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基因可变剪接是调节基因表达和产生蛋白质多样性的重要机制,也是导致真核生物基因和蛋白质数量较大差异的重要原因。可变剪接是目前基因表达调控领域的研究热点,然而,关于可变剪接所产生的异构体在家禽肝脏脂质合成过程中的作用机理和调控机制的研究鲜有报道。本研究利用Nanopore实时单分子纳米孔三代测序技术平台对产蛋前期20W和产蛋高峰期30W卢氏绿壳蛋鸡肝脏组织进行全长转录组测序,在全转录组水平分析基因可变剪接异构体在脂质代谢显著差异的肝脏组织中的变化情况;利用qRT-PCR等技术分析甘油三酯合成关键基因AGPAT2可变剪接异构体在蛋鸡不同发育时期肝脏中的表达规律,构建雌激素处理个体和细胞模型,研究雌激素对蛋鸡AGPAT2可变剪接异构体表达水平的影响;利用功能获得试验验证AGPAT2基因可变剪接异构体在PA与TG合成中的作用,最终阐明AGPAT2可变剪接异构体在鸡肝脏脂质合成过程中的作用。主要结果如下:1、产蛋前期和产蛋高峰期鸡肝脏组织全长转录组分析。分别采集产蛋前期(20周龄)和产蛋高峰期(30周龄)卢氏绿壳蛋鸡肝脏组织各3个,利用Nanopore实时单分子纳米孔三代测序技术平台进行全长转录组测序,每个样品测序产出Clearn date均达到16.87GB。可变剪接数据分析显示,相较于产蛋前期20W,在产蛋高峰期30W可变剪接事件发生数量显著增加。外显子跳跃是这两个生理阶段广泛存在的调节机制;此次分析鉴定到在20W特异性表达转录本1482个,30W为2248个;GO功能富集分析显示,20W与30W特异性表达转录本显著富集的前16个条目相似,然而,30W富集的转录本数量明显多于20W。进一步对两个时期共同存在基因的转录本分析,鉴定到差异表达转录本1 106个,与产蛋前期相比,828个上调,278个下调。通过差异表达转录本进行通路富集分析发现,差异表达转录本主要与富集在脂质代谢相关的通路中。2、AGPA T2基因可变剪接异构体结构及功能域分析。对差异表达转录本进行分析,筛选到了富集在脂肪酸代谢通路中的且在30W肝脏组织测序数据中高表达的关键候选基因AGPA T2;通过对该基因的进一步分析,发现AGPAT2基因有5个可变剪接异构体,分别将其命名为AGPAT2a、AGPAT2b、AGPAT2c、AGPAT2d、AGPAT2e。功能结构域分析发现 AGPAT2(a-e)均具有典型的plsc功能结构域,且转录本AGPAT2a具有信号肽和跨膜结构域。3、AGPAT2基因可变剪接异构体的表达特性分析。qRT-PCR检测AGPAT2基因可变剪接异构体在20W与30W卢氏绿壳蛋母鸡肝脏中的表达模式,结果显示,相较于20W,AGPAT2a和AGPAT2b的表达量均在产蛋高峰期的30周不同程度的升高,且AGPAT2a显著高于AGPAT2b;而AGPAT2(c-e)的表达量较低且差异不显著。推测相较于AGPAT2(c-e),AGPAT2a与AGPAT2b在甘油三酯合成中发挥着主要作用。雌激素处理个体和细胞试验结果显示,AGPAT2a在鸡肝脏组织及鸡胚肝原代细胞中表达一致,而AGPAT2b只在高浓度处理组的肝脏组织中显著表达,在细胞中则无明显变化。表明AGPAT2a的表达受雌激素调控,AGPAT2b有待进一步研究。4、AGPAT2可变剪接异构体亚细胞定位。成功构建PcDNA3.1-AGPAT2a/AGPAT2b-EGFP过表达载体,与内质网标记蛋白质粒ER-dsred-λ共转染鸡LMH细胞中,在激光共聚焦显微镜下确定AGPAT2a和AGPAT2b在细胞中的位置,结果显示:鸡AGPAT2a蛋白与内质网标签蛋白荧光发生融合,共定位于细胞内质网中,而AGPAT2b蛋白则不与其融合,说明AGPAT2b不定位在内质网中。5、AGPAT2基因可变剪接异构体功能获得研究。分别过表达AGPAT2a和AGPAT2b,检测鸡LMH细胞中PA和TG的含量,结果表明,过表达AGPAT2a后,PA和TG的含量显著升高(P<0.01),而过表达AGPAT2b则对直接产物PA的生成无影响(P>0.05),但却促进了终产物TG含量的升高(P<0.01),由此可见,AGPAT2a基因在鸡PA合成过程中发挥主要作用,而二者均能促进终产物TG的生成。综上所述,产蛋高峰期30W可变剪接事件发生数量显著高于产蛋前期20W;外显子跳跃,是这两个生理阶段广泛存在的调节机制;20W与30W特异性表达转录本显著富集的前16个GO条目相似,然而,相较于20W,在30W显著富集的通路转录本数量明显增多。AGPAT2基因存在5个可变剪接异构体,只有AGPAT2a,AGPAT2b基因在产蛋高峰期(30W)母鸡肝脏中的表达量水平不同程度升高,且AGPAT2a显著高于AGPAT2b;AGPAT2a的表达受雌激素调控。AGPAT2a定位在内质网中,可能参与内质网中磷脂的组装与转运,AGPAT2b则不定位于内质网中;过表达AGPAT2a可显著升高胞内PA和TG含量,而过表达AGPAT2b只对终产物TG的生成有促进作用。