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[目的]肝脏缺血再灌注损伤(Hepatic ischemiareperfusion injury HIRI)常发生在肝移植、肝切除等需要对入肝血流进行全部或部分阻断的肝胆外科手术操作中,表现为肝脏血液供应恢复后,肝功能不仅未得到改善,反而使损伤进一步加重的现象。因此,寻找一种最小化HIRI的方法变得迫切需要。在预防或治疗HIRI的研究中,机械性缺血预处理(ischemic preconditioning,IPC)和药物预处理是临床及基础实验研究中常采用的两种预处理方式。缺血预处理已被诸多研究证明是一种有效的处理方法。选用何种药物来进行药物预处理的研究,我们认为至少要与缺血预处理效果相当甚至更优。目前,在有关缺血预处理的研究中,何种缺血预处理方案能够为减轻HIRI提供最佳的效果并不明确。已知人参皂甙Rg1具有改善微循环、抗氧化、抗凋亡等多重药理功效,能够有效减轻心、脑、肝等组织器官的I/R损伤。然而,在HIRI的研究中,对于Rg1减轻I/R损伤的具体作用机制并不清楚。目前研究认为线粒体凋亡途径和线粒体自噬途径是HIRI病理生理过程中可调控的两个重要通路,而亲环蛋白D(CyclophilinD,CypD)蛋白又被认为与线粒体结构和功能密切相关。因此本研究的目的是首先明确提供最佳保护的缺血预处理方案,从而为选择Rg1作为药物预处理的目标药物提供参照;其次,从CyPD这一作用靶点探讨Rg1通过线粒体途径减轻HIRI的作用机制,为临床医疗中使用中药制剂来防治HIRI提供一定的理论依据。[方法]①建立大鼠肝脏部分(70%)热缺血再灌注损伤模型,分别予以5-10min-IPC、10-10min-IPC、循环3次的5-5min-IPC这三种缺血预处理措施。通过检测肝功能、SOD活性、GSH含量、MDA含量、组织病理学改变、肝细胞凋亡,优选出最佳的缺血预处理方案。②我们通过Rg1预处理与最佳缺血预处理方案的处理进行比较,通过检测肝功能、SOD活性、GSH含量、MDA含量、组织病理学改变、肝细胞凋亡,评价两者对HIRI的保护效果,明确选定Rg1进行后续药物预处理研究的可行性及意义。③分别在体内大鼠肝脏热缺血再灌注损伤模型和体外OGD/R处理的大鼠BRL-3A细胞模型中,经过Rg1预处理后,通过TUNEL法、Annexin V-AF647-PI双染法检测细胞凋亡水平,western blot检测细胞凋亡相关信号分子(Cyt-c,Caspase9,Caspase3)的蛋白质表达,观察Rg1预处理对大鼠肝细胞凋亡的影响。通过检测CypD的蛋白质表达水平、线粒体跨膜电位、线粒体钙保留能力,透射电镜观察线粒体结构,进一步观察Rg1预处理对肝细胞线粒体凋亡途径的影响。同时评估大鼠肝功能和组织学损伤以及体外BRL-3A细胞损伤以明确Rg1的有效性。④使用IRI体内外模型,通过检测不同再灌注时间点的线粒体自噬关键蛋白(LC3I,LC3II,p62,PINK1和Parkin)明确过度线粒体自噬的时间点;然后,予以Rg1预处理后,通过TUNEL法、Annexin V-AF647-PI双染法检测细胞凋亡水平,western blot检测线粒体自噬相关信号分子(LC3I,LC3II,p62,PINK1和Parkin)的蛋白质表达水平,检测线粒体跨膜电位,透射电镜观察线粒体自噬体的数量,检测体内肝功能和组织病理学改变以及体外BRL-3A细胞增殖活力,观察Rg1预处理对线粒体自噬途径的调控作用,从而进一步完善Rg1通过线粒体途径保护HIRI的作用机制。[结果]①在大鼠动物模型研究中发现,与I/R组相比较,三种IPC方案均显示出肝转氨酶的活性水平明显降低,组织病理学损伤改变减轻,SOD活性和GSH含量升高,MDA含量降低;其中实施循环3次5-5min-IPC方案的改变最为明显,表明其减轻I/R损伤的效果最佳。②将Rg1预处理与IPC 比较研究后发现,两者的肝转氨酶的活性水平、组织病理学损伤、SOD活性、GSH含量、MDA含量表现出相似的变化结果,两者联合处理后上述指标改变更加明显;这表明,Rg1预处理能够达到与IPC相同的效果,两者还具有累加效应。③研究发现,在体内大鼠HIRI模型研究中,与I/R组相比,Rg1预处理可降低ALT和AST活性水平,减轻肝脏组织病理学损伤变化和细胞凋亡;在体外BRL-3A细胞OGD/R模型研究中,40μM Rg1预处理24h能够提供最佳的保护作用,Rg1显著增强细胞活力,抑制细胞凋亡;在体内和体外模型中,Rg1可抑制CypD的表达,稳定线粒体跨膜电位,提高CRC,保护线粒体结构和功能,限制线粒体凋亡途径,减少肝细胞凋亡;并且在体外研究中,这种有益作用被H2O2所抑制;这表明,Rg1预处理可能通过抑制CypD的表达,限制线粒体凋亡途径减轻HIRI。④在体内动物实验和体外BRL-3A细胞实验中发现,在体内再灌注6h后线粒体自噬相关蛋白表达水平最高并肝转氨酶活性水平最高,在体外复氧复糖6h后线粒体自噬相关蛋白表达水平最高;在体内,与I/R组相比,Rg1预处理明显降低了 ALT和AST的活性水平,肝脏组织学损伤变化明显减轻;在体外,Rg1预处理明显增强了细胞增殖活力;在体内外研究中均发现Rg1预处理后线粒体自噬关键蛋白(LC3I,LC3II,p62,PINK1和Parkin)的蛋白质表达下降,细胞凋亡水平明显降低、线粒体跨膜电位明显升高,线粒体自噬体的数目减少;提示在再灌注期过度的线粒体自噬加重损伤,Rg1预处理可能通过抑制线粒体自噬,减轻了 HIRI。[结论]1.循环3次的5-5min-IPC方案提供了 IPC对肝脏缺血再灌注损伤的最佳的保护;2.Rg1预处理减轻大鼠HIRI,并且能够达到与IPC相同的效果,可能是通过抗氧化应激损伤减少肝细胞凋亡来实现的;3.Rg1能够有效降低CypD蛋白的表达;4.Rg1可通过抑制CypD蛋白的表达,调控MPTP的开放,限制线粒体凋亡途径,从而减轻大鼠HIRI;5.在HIRI的再灌注阶段,过度的线粒体自噬导致损伤加重;6.Rg1通过抑制PINK1/Parkin信号通路的激活,从而减轻再灌注期发生的过度的线粒体自噬,减轻HIRI;其部分作用机制是通过抑制CypD蛋白表达,抑制MPTP的开放而实现的。