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犬副流感(Canine parainfluenza)是由犬副流感病毒(Canine parainfluenza virus,CPIV)引起的一种犬的呼吸道传染病,临床上以发热、咳嗽和流涕为特征。CPIV也可引起急性脑脊髓炎和脑积水,临床表现为后肢麻痹和运动失调等。疫苗接种能有效预防该病,弱毒疫苗是目前使用最为广泛的犬副流感疫苗。本研究对犬副流感弱毒疫苗株NL/CPI/5进行了全基因组序列测定,并与GenBank中19株5型副流感病毒分离株基因组进行比较分析,结果显示:NL/CPI/5株全基因组长为15246个核苷酸(Nucleotides,nt),与2014~2017年在中国分离的CC-14、ZJQ-221、BC14和HeN0718四个CPIV毒株的全基因组核苷酸数量一致。NL/CPI/5株与2009年韩国分离毒株1168-1的核苷酸序列同源性最高,同源率为99.9%,与中国分离毒株ZJQ-221、CC-14、BC14和HeN0718株的核苷酸同源率较高,分别为99.8%、99.1%、99%和97.1%。NL/CPI/5株与ZJQ-221、CC-14、BC14和HeN0718株F蛋白基因的核苷酸同源率分别为99.7%、99.2%、99.2%和96.4%,氨基酸同源率分别为98.9%、98.6%、98.6%和96.2%。NL/CPI/5株与ZJQ-221、CC-14、BC14和HeN0718株HN蛋白基因的核苷酸同源率分别为99.5%、99.4%、99.3%和97.8%,氨基酸同源率分别为98.9%、98.8%、98.6%和97.5%。分析结果表明:我国CPIV流行毒株遗传基本稳定,主要抗原蛋白F和HN基因变异率比较低,与弱毒疫苗株NL/CPI/5主要蛋白基因序列和氨基酸序列差异均不明显。CPIV可以感染许多动物和人,感染其它动物和人一般呈现隐性感染,不引起疾病,仅仅感染犬可引起呼吸道疾病。因此,CPIV具有作为活疫苗载体的潜力。反向遗传操作技术的发展和成熟,使得犬副流感弱毒疫苗株作为新型活病毒疫苗载体成为可能。在弱毒疫苗株NL/CPI/5全基因组序列测定的基础上,构建了该疫苗株基因组全长cDNA克隆,并在基因组上游引入锤头状核酶序列(Hammerhead ribozyme sequence,HamRz),在基因组下游引入丁型肝炎病毒核酶序列(Hepatitis delta virus ribozyme sequence,HdvRz),并克隆至真核表达载体pCI中CMV-IE启动子下游,构成NL/CPI/5株基因组全长cDNA克隆质粒pCI-CPIV。在此基础上,再通过PCR方法在cDNA P和M蛋白基因ORF之间进行碱基定点突变,引入MluⅠ和SalⅠ限制性酶切位点,并分别将报告基因GFP基因和狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)ERA疫苗株的G蛋白基因插入到MluⅠ和SalⅠ位,同时在GFP或ERA G蛋白基因下游引入CPIV自身聚合酶蛋白L识别的转录终止序列GE及自身聚合酶蛋白M识别的转录起始序列GS,构成分别含有GFP基因和ERA株G蛋白基因的重组NL/CPI/5株基因组全长cDNA克隆质粒pCI-CPIV-EGFP和pCI-CPIV-ERAG。同时,分别将NL/CPI/5株N、P、L蛋白基因克隆至真核表达载体pCI中CMV-IE启动子下游,构成分别表达NL/CPI/5株N、P、L蛋白的辅助质粒pCI-CPIVN、pCI-CPIVP和pCI-CPIVL。采用磷酸钙转染的方法,用质粒pCI-CPIV-EGFP、pCI-CPIVN、pCI-CPIVP和pCI-CPIVL共转染BSR细胞,转染后2d在荧光显微镜下可观察到表达GFP的BSR细胞,表明含有GFP基因的CPIV基因组cDNA在CMV-IE启动子作用下可正确转录,核酶HamRz和HdvRz也能精确剪切,形成与病毒RNA一致的RNA分子,同时3个辅助质粒也能正确的表达CPIV N、P和L蛋白,为建立CPIV反向遗传操作技术平台奠定了基础。