【摘 要】
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本文探讨了家蚕精子介导基因转移技术(交配囊注射法)能否有效地将外源基因导入并整合于家蚕基因组中使之稳定遗传,以及转移的外源DNA浓度、线性化与否等对外源基因转移效率的
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本文探讨了家蚕精子介导基因转移技术(交配囊注射法)能否有效地将外源基因导入并整合于家蚕基因组中使之稳定遗传,以及转移的外源DNA浓度、线性化与否等对外源基因转移效率的影响。在同源重组绿色荧光蛋白表达载体pG350的基础上,以pMD18-T为质粒载体,用egfp基因替换gfp基因,构建了家蚕核型多角体病毒早期即刻蛋白基因启动子BmNPV-IE控制下的增强型绿色荧光蛋白表达载体pMD-Fib-IE-EGFP。采用本实验室建立的蚕蛾交配囊直接注射法(将外源DNA直接注入处女蛾交配囊中再与同种雄蛾交配产卵),历时3年,先后进行了2次家蚕精子介导基因转移实验。2000年用线性化的pG350进行家蚕精子介导基因转移实验,在14个G0代实验蛾区的DNA样品中有5个DNA样品PCR检测为阳性,阳性率35. 7%,对G1代的PCR与杂交检测证明导入的GFP基因存在于G1代的家蚕基因组中;2002年实验用了pMD-Fib-IE-EGFP和pEGFP-N3两个质粒进行基因转移实验,pMD-Fib-IE-EGFP以线状和环状两种构象分别用了2. 0、 1. 4、 0. 7mg/mL 三个浓度共6组进行外源基因转移实验,pEGFP-N3以1. 2mg/mL环状的条件进行外源基因转移实验。对得到的G0代97个蛾区DNA样品进行了PCR和杂交检测。在注射pMD-Fib-IE-EGFP的6组(X20、 X14、 X07、 H20、 H14、 H07) 中PCR阳性率分别为55. 0%(11/20) 、78. 6%(11/14) 、53. 3%(8/15) 、50. 0%(8/16) 、58. 3%(7/12) 和71. 4%(5/7) ,注射pEGFP-N3的一组PCR阳性率46. 2%(6/13) ,对PCR阳性的DNA样品进一步做杂交检测的结果表明导入的EGFP基因整合在G0代家蚕基因组中。 紫外灯荧光检测,2次实验都未看到实验组与对照组家蚕间有显著 差异,而2002年实验取家蚕4龄幼虫生殖细胞观察,有部分实验家蚤的 生殖细胞在紫外光下发绿色荧光。 本研究的结果证明了精于介导基因转移方法(交配囊注射法)能将 外源基因有效地导入并整合于家蚕基因组,导入的外源基因可能是以串 联多拷贝的形式整合于家蚕基因组中,整合的外源基囚叶@传午G;代。
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