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目的:探索Wnt5a调控Sertoli细胞连接功能的分子机制,阐明Wnt5a通过与其受体ROR2结合,维持m TORC1和m TORC2活性的平衡,保障肌动蛋白结合蛋白（actin binding proteins,ABPs）的正常表达,进而调控Sertoli细胞中F-actin的成束和分支变化,从而使血睾屏障（blood-testis barrier,BTB）和顶部的细胞外质特化（apical ectoplasmic specialization,apical ES）正常“打开”和“关闭”,保障精子生成和释放,为临床诊疗男性不育提供新的重要靶点。方法:第一部分:将9只成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠随机分为3组:正常对照组、Adjudin组（50 mg/kg b.w.）、Cd Cl2组（3mg/kg b.w.）。Adjudin和Cd Cl2分别是损伤apical ES和BTB的常规药物。Adjudin组灌胃1次,Cd Cl2组腹腔注射1次,分别在第4天和第3天收取睾丸组织。建模成功后,采用WB检测3组睾丸组织中Wnt5a的表达水平。通过IF检测Wnt5a在生精上皮周期的时空表达模式、Wnt5a与BTB相关连接蛋白（ZO-1、N-cadherin、β-catenin、Cx43、F-actin）的表达共定位。随后,随机选取16只成年雄性SD大鼠,使用转染试剂Polyplus in vivo-jet PEI作为Wnt5a si RNA（100 n M）的载体,通过睾丸内注射的方法,将转染溶液注射进入SD大鼠的左侧睾丸,右侧睾丸注射等量非靶向对照si RNA试剂作为对照组。转染溶液隔天注射一次（第1、3、5天）,第8天建模结束,收取左右侧睾丸。随后WB及IF检测Wnt5a在睾丸组织中的敲低效率,HE染色检测睾丸生精功能的损伤情况。通过WB、IF及免疫组化检测睾丸组织BTB相关连接蛋白（ZO-1、occludin、N-cadherin、β-catenin、Cx43）及ABPs（Arp3和Eps8）的表达水平及定位情况。通过生物素示踪实验检测Ctrl si RNA组、Wnt5a si RNA组和Cd Cl2处理组的BTB完整性。最后,通过WB检测极性蛋白CDC42、Wnt5a的受体ROR2、m TORC1及m TORC2信号通路相关指标（rictor、p-rps6、rps6、Akt、p-Akt、MMP9）的表达情况。第二部分:采用TM4细胞系（小鼠睾丸Sertoli细胞）作为体外实验的研究对象。使用转染试剂LipofectamineTMRNAi MAX Transfection Reagent作为载体,分别与Ctrl si RNA、Wnt5a si RNA（15n M）混合,转染2次。72 h后,WB检测Wnt5a的敲低效率及BTB相关连接蛋白（ZO-1、occludin、N-cadherin、β-catenin、Cx43）及ABPs（Arp3、Eps8）的表达情况,IF检测F-actin及Arp3的表达情况。最后,通过WB检测极性蛋白CDC42、Wnt5a的受体ROR2、m TORC1及m TORC2信号通路相关指标（rictor、p-rps6、rps6、Akt、p-Akt、MMP9）的表达情况。结果:第一部分:Adjudin组及Cd Cl2组SD大鼠睾丸组织中Wnt5a的表达明显下降,提示Wnt5a可能参与调控BTB和apical ES的连接功能。Wnt5a在睾丸组织中呈现特异的时空表达模式。在BTB,Wnt5a于生精上皮周期第VII和VIII阶段高表达;在apical ES,Wnt5a于生精上皮周期VII阶段有点状特异性表达,于第VIII阶段表达明显减少甚至消失。IF显示Wnt5a与F-actin、ZO-1、N-cadherin、β-catenin、Cx43共定位于BTB。HE染色结果显示,Wnt5a敲低后,精子细胞极性丢失,滞留于生精上皮,吞噬体不能运输至生精上皮的基底部,说明apical ES完整性受损。Wnt5a敲低后,BTB相关连接蛋白ZO-1、occludin、N-cadherin、β-catenin、Cx43表达明显减少,Arp3表达增加,Eps8表达减少,提示BTB完整性受损。通过生物素示踪实验进一步验证Wnt5a敲低导致BTB完整性被破坏。Wnt5a敲低导致ROR2、Rictor、MMP9、CDC42的表达下降,p-rps6/rps6及p-Akt/Akt表达升高,说明Wnt5a敲低导致m TORC1和m TORC2之间活性的失衡。第二部分:在TM4细胞中Wnt5a敲低后,BTB相关连接蛋白ZO-1、occludin、N-cadherin、β-catenin、Cx43的表达明显减少,Eps8的表达亦降低减少,但Arp3表达水平无明显改变。IF结果显示,F-actin的结构紊乱及Arp3的表达定位由细胞膜转移至细胞质。m TORC1及m TORC2信号通路相关指标表达与体内结果一致,提示Wnt5a是通过其受体ROR2调控m TORC1与m TORC2之间的活性平衡以维持Sertoli细胞的连接功能。结论:Wnt5a通过与其受体ROR2结合,维持m TORC1和m TORC2活性的平衡,保障ABPs的正常表达,进而调控Sertoli细胞中F-actin的成束和分支变化,从而确保BTB和apical ES的动态稳定,确保精子正常发生。