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由松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)引起的松萎蔫病(pine wilt disease)是一种极具毁灭性的松林病害，在世界范围内引起了巨大的经济损失和严重的生态灾难。松材线虫引起松树死亡是一个复杂的过程，涉及松材线虫、宿主松树以及松材线虫的伴生菌。越来越多的研究表明，不同来源的松材线虫株系具有不同的致病性，某些松材线虫伴生菌对松材线虫的发育有一定的促进作用，但目前有关松材线虫发育与致病分子机制研究仍然不多。
在前期研究中，通过分析携带荧光假单胞菌松材线虫以及无菌线虫转录组数据，筛选出可能与醇代谢密切相关的编码醇脱氢酶的上调差异表达基因adh-1。通过PCR技术克隆出松材线虫adh-1基因的开放阅读框(Open reading frame，ORF)，构建原核表达系统，获得可溶性重组醇脱氢酶并进行酶活测定分析，酶活测定结果表明，松材线虫醇脱氢酶对包含甲醇、乙醇以及正丙醇在内的多种醇都具有一定的催化活性，具有广泛地底物特异性。实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR, qRT-PCR)的检测结果表明，环境中的乙醇可以显著引起其adh-1基因上调表达。上述结果表明，松材线虫adh-1基因所编码的蛋白确实为醇脱氢酶，并可以催化包含乙醇在内的多种醇的氧化反应；且在一定乙醇浓度下，环境中的乙醇与松材线虫adh-1基因表达量之间存在着相关性。
在本次研究中，我们对松材线虫adh-1基因的基因结构以及生物信息学信息进行了进一步的分析，结果表明，编码松材线虫醇脱氢酶的adh-1基因全长1458bp，其5’端包含一个长度为52bp的非编码序列(Untranslated region，UTR)，3’端包含一个48bp的非编码序列；松材线虫adh-1基因完整的ORF全长是1059bp，编码352个氨基酸残基的蛋白；此外，松材线虫adh-1基因还包含3个长度分别为291,189和579bp的外显子以及2个长度分别为92和206bp的内含子，且内含子符合“GT-AG”的剪切原则。松材线虫醇脱氢酶氨基酸序列相似性分析的结果表明，松材线虫醇脱氢酶氨基酸序列与秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis. elegans)以及布氏隐杆线虫(Caenorhabditis. briggsae)的醇脱氢酶相似度最高，相似度分别达到了55%和54%。SignalP4.0和TMHMMserver2.0软件的信号肽以及跨膜结构预测结果表明，松材线虫醇脱氢酶并不包含信号肽序列以及跨膜结构域，说明该酶可能是一种胞内酶且不是跨膜蛋白。
为了深入研究adh-1基因在松材线虫体内的生物学功能，本研究利用RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术以降低adh-1的表达水平，并比较了RNAi线虫和对照线虫的性状差异。RNA干扰研究的结果表明，松材线虫adh-1基因被干扰(下调表达)后，松材线虫体内醇脱氢酶活力、对环境乙醇的耐受性、运动性、繁殖力以及对灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的取食能力都出现显著降低；而醇脱氢酶抑制剂甲吡唑处理松材线虫后，松材线虫体内的醇脱氢酶活力、运动性、繁殖力以及对灰葡萄孢的取食能力也出现显著降低趋势。上述实验结果说明，松材线虫adh-1基因参与了对其运动性和繁殖力的调控。此外，我们还进一步研究了环境中低浓度乙醇与松材线虫adh-1基因表达量之间的关系，结果表明，松材线虫经0.1%、0.5%和1.0%浓度乙醇处理24h后，其adh-1基因表达水平明显高于对照组中无菌水处理的松材线虫，分别是对照组的1.34、1.78和2.10倍。该结果说明，低浓度的乙醇可以诱导松材线虫adh-1基因的表达，且在一定乙醇浓度范围内，adh-1基因表达量随着乙醇浓度的增加而增高，这说明adh-1基因与松材线虫体内的乙醇代谢密切相关。
为了了解甲吡唑对松材线虫的毒性，本研究测定了甲吡唑处理松材线虫24h和48h的LC50和LC90。结果表明，在24h和48h时，甲吡唑对松材线虫的LC50分别是0.026mM和0.025mM，LC90分别是0.040mM和0.038mM，在24h和48h这两个时间点上，甲吡唑对松材线虫的LC50差异并不显著，这表明甲吡唑达到一定浓度时，该药物对松材线虫具有快速的致死作用；在甲吡唑处理松材线虫24h时，0.055mM甲吡唑溶液对松材线虫展现出了约100%的致死效果。上述关于甲吡唑对松材线虫毒性的研究结果将为杀松材线虫以及防控松萎蔫病药剂的开发和创新提供新的实验依据。
为了深入研究甲吡唑影响松材线虫运动与繁殖的分子机制，在本研究中，我们利用Illumina测序技术对0.02mM甲吡唑处理24h的松材线虫(实验组)以及无菌水处理的松材线虫(对照组)的转录组进行了高通量测序，并通过深入分析转录组数据挖掘出调控松材线虫运动与繁殖的差异表达基因和代谢通路。NCBINR、GeneOntology(GO)以及KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes(KEGG)数据库对差异表达基因的功能注释结果表明，在甲吡唑处理组松材线虫中，共有3114个差异表达基因，其中包含2124个上调基因和490个下调基因，而差异倍数在2倍以上的差异表达基因共有367个，其中包括214个上调基因和153个下调基因(FDR＜0.001)。一些具有潜在调节松材线虫运动性与繁殖能力的关键差异表达基因以及代谢通路在本研究中进行了详细的阐述，例如：MAPK信号途径中的有丝分裂活化蛋白激酶7(MAPK7)基因、热休克蛋白70(HSP70)基因和核糖体S6激酶(RSK)基因；核糖体中的40S核糖体蛋白S8-1基因、40S核糖体蛋白S12基因和40S核糖体蛋白S18基因；乙酰胆碱酯酶(AchE)基因。根据转录组数据以及所获得的差异基因的注释结果，从差异表达基因中随机选择7个基因，包括3个上调基因和4个下调基因，通过实时荧光定量PCR技术对其表达水平进行了验证，结果表明，随机筛选的差异基因的表达水平与转录组测序结果大体一致，证实了转录组数据结果的可靠性。此外，通过分析甲吡唑处理组松材线虫转录组数据，我们筛选到了影响线虫发育、寿命、生殖细胞形成等生理过程相关的差异表达基因以及代谢通路，表明甲吡唑对线虫的其他生命活动也可能会有调控作用，为此，我们进行了进一步的实验验证，结果表明，甲吡唑处理组松材线虫幼虫的发育、线虫的寿命、雌虫的产卵率以及线虫卵的孵化率都出现显著降低。上述实验结果表明，甲吡唑对松材线虫的多种生理功能都具有明显的抑制作用。
综上所述，本研究首先通过分析携带荧光假单胞菌松材线虫以及无菌线虫转录组数据，筛选出与醇代谢密切相关的编码醇脱氢酶的上调差异表达基因adh-1，并对松材线虫adh-1的基因结构以及生物信息学信息进行了进一步的分析；其次，通过RNAi技术与醇脱氢酶抑制剂甲吡唑相结合的方法，研究了adh-1基因在松材线虫体内的生理功能，证实了与醇代谢密切相关的adh-1基因确实参与了对松材线虫运动和繁殖的调控，并且进一步研究证实了环境中低浓度乙醇与adh-1基因表达水平之间存在正相关性；最后，我们测定了甲吡唑对松材线虫的毒性，并通过转录组学技术分析了表达水平受甲吡唑显著影响的松材线虫基因，挖掘出一些与松材线虫运动性、繁殖力以及发育相关的差异表达基因以及代谢通路；并通过qRT-PCR技术验证了转录组数据分析结果的可靠性；同时，实验证实了甲吡唑对松材线虫幼虫的发育、寿命、雌虫产卵率以及线虫卵的孵化率都具有显著的干扰效果。
本文通过对adh-1的基因功能和甲吡唑的作用机制进行研究，初步确定adh-1基因参与调控松材线虫运动、繁殖等生理活动，对松材线虫的扩散与增殖影响较大，有望成为控制松材线虫的一个靶点；甲吡唑作为adh-1基因编码的醇脱氢酶抑制剂，在μM量级就对松材线虫的一些关键基因表达产生显著影响，从而引起代谢紊乱而呈现明显的杀线活性，使甲吡唑及其衍生物有望成为一种新型的杀线药物。本文研究结果对于深入了解松材线虫发育和致病的分子机理有一定的参考作用，对于松萎蔫病的防控药物的研发也提供了一种新的选择。
在前期研究中，通过分析携带荧光假单胞菌松材线虫以及无菌线虫转录组数据，筛选出可能与醇代谢密切相关的编码醇脱氢酶的上调差异表达基因adh-1。通过PCR技术克隆出松材线虫adh-1基因的开放阅读框(Open reading frame，ORF)，构建原核表达系统，获得可溶性重组醇脱氢酶并进行酶活测定分析，酶活测定结果表明，松材线虫醇脱氢酶对包含甲醇、乙醇以及正丙醇在内的多种醇都具有一定的催化活性，具有广泛地底物特异性。实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR, qRT-PCR)的检测结果表明，环境中的乙醇可以显著引起其adh-1基因上调表达。上述结果表明，松材线虫adh-1基因所编码的蛋白确实为醇脱氢酶，并可以催化包含乙醇在内的多种醇的氧化反应；且在一定乙醇浓度下，环境中的乙醇与松材线虫adh-1基因表达量之间存在着相关性。
在本次研究中，我们对松材线虫adh-1基因的基因结构以及生物信息学信息进行了进一步的分析，结果表明，编码松材线虫醇脱氢酶的adh-1基因全长1458bp，其5’端包含一个长度为52bp的非编码序列(Untranslated region，UTR)，3’端包含一个48bp的非编码序列；松材线虫adh-1基因完整的ORF全长是1059bp，编码352个氨基酸残基的蛋白；此外，松材线虫adh-1基因还包含3个长度分别为291,189和579bp的外显子以及2个长度分别为92和206bp的内含子，且内含子符合“GT-AG”的剪切原则。松材线虫醇脱氢酶氨基酸序列相似性分析的结果表明，松材线虫醇脱氢酶氨基酸序列与秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis. elegans)以及布氏隐杆线虫(Caenorhabditis. briggsae)的醇脱氢酶相似度最高，相似度分别达到了55%和54%。SignalP4.0和TMHMMserver2.0软件的信号肽以及跨膜结构预测结果表明，松材线虫醇脱氢酶并不包含信号肽序列以及跨膜结构域，说明该酶可能是一种胞内酶且不是跨膜蛋白。
为了深入研究adh-1基因在松材线虫体内的生物学功能，本研究利用RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术以降低adh-1的表达水平，并比较了RNAi线虫和对照线虫的性状差异。RNA干扰研究的结果表明，松材线虫adh-1基因被干扰(下调表达)后，松材线虫体内醇脱氢酶活力、对环境乙醇的耐受性、运动性、繁殖力以及对灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的取食能力都出现显著降低；而醇脱氢酶抑制剂甲吡唑处理松材线虫后，松材线虫体内的醇脱氢酶活力、运动性、繁殖力以及对灰葡萄孢的取食能力也出现显著降低趋势。上述实验结果说明，松材线虫adh-1基因参与了对其运动性和繁殖力的调控。此外，我们还进一步研究了环境中低浓度乙醇与松材线虫adh-1基因表达量之间的关系，结果表明，松材线虫经0.1%、0.5%和1.0%浓度乙醇处理24h后，其adh-1基因表达水平明显高于对照组中无菌水处理的松材线虫，分别是对照组的1.34、1.78和2.10倍。该结果说明，低浓度的乙醇可以诱导松材线虫adh-1基因的表达，且在一定乙醇浓度范围内，adh-1基因表达量随着乙醇浓度的增加而增高，这说明adh-1基因与松材线虫体内的乙醇代谢密切相关。
为了了解甲吡唑对松材线虫的毒性，本研究测定了甲吡唑处理松材线虫24h和48h的LC50和LC90。结果表明，在24h和48h时，甲吡唑对松材线虫的LC50分别是0.026mM和0.025mM，LC90分别是0.040mM和0.038mM，在24h和48h这两个时间点上，甲吡唑对松材线虫的LC50差异并不显著，这表明甲吡唑达到一定浓度时，该药物对松材线虫具有快速的致死作用；在甲吡唑处理松材线虫24h时，0.055mM甲吡唑溶液对松材线虫展现出了约100%的致死效果。上述关于甲吡唑对松材线虫毒性的研究结果将为杀松材线虫以及防控松萎蔫病药剂的开发和创新提供新的实验依据。
为了深入研究甲吡唑影响松材线虫运动与繁殖的分子机制，在本研究中，我们利用Illumina测序技术对0.02mM甲吡唑处理24h的松材线虫(实验组)以及无菌水处理的松材线虫(对照组)的转录组进行了高通量测序，并通过深入分析转录组数据挖掘出调控松材线虫运动与繁殖的差异表达基因和代谢通路。NCBINR、GeneOntology(GO)以及KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes(KEGG)数据库对差异表达基因的功能注释结果表明，在甲吡唑处理组松材线虫中，共有3114个差异表达基因，其中包含2124个上调基因和490个下调基因，而差异倍数在2倍以上的差异表达基因共有367个，其中包括214个上调基因和153个下调基因(FDR＜0.001)。一些具有潜在调节松材线虫运动性与繁殖能力的关键差异表达基因以及代谢通路在本研究中进行了详细的阐述，例如：MAPK信号途径中的有丝分裂活化蛋白激酶7(MAPK7)基因、热休克蛋白70(HSP70)基因和核糖体S6激酶(RSK)基因；核糖体中的40S核糖体蛋白S8-1基因、40S核糖体蛋白S12基因和40S核糖体蛋白S18基因；乙酰胆碱酯酶(AchE)基因。根据转录组数据以及所获得的差异基因的注释结果，从差异表达基因中随机选择7个基因，包括3个上调基因和4个下调基因，通过实时荧光定量PCR技术对其表达水平进行了验证，结果表明，随机筛选的差异基因的表达水平与转录组测序结果大体一致，证实了转录组数据结果的可靠性。此外，通过分析甲吡唑处理组松材线虫转录组数据，我们筛选到了影响线虫发育、寿命、生殖细胞形成等生理过程相关的差异表达基因以及代谢通路，表明甲吡唑对线虫的其他生命活动也可能会有调控作用，为此，我们进行了进一步的实验验证，结果表明，甲吡唑处理组松材线虫幼虫的发育、线虫的寿命、雌虫的产卵率以及线虫卵的孵化率都出现显著降低。上述实验结果表明，甲吡唑对松材线虫的多种生理功能都具有明显的抑制作用。
综上所述，本研究首先通过分析携带荧光假单胞菌松材线虫以及无菌线虫转录组数据，筛选出与醇代谢密切相关的编码醇脱氢酶的上调差异表达基因adh-1，并对松材线虫adh-1的基因结构以及生物信息学信息进行了进一步的分析；其次，通过RNAi技术与醇脱氢酶抑制剂甲吡唑相结合的方法，研究了adh-1基因在松材线虫体内的生理功能，证实了与醇代谢密切相关的adh-1基因确实参与了对松材线虫运动和繁殖的调控，并且进一步研究证实了环境中低浓度乙醇与adh-1基因表达水平之间存在正相关性；最后，我们测定了甲吡唑对松材线虫的毒性，并通过转录组学技术分析了表达水平受甲吡唑显著影响的松材线虫基因，挖掘出一些与松材线虫运动性、繁殖力以及发育相关的差异表达基因以及代谢通路；并通过qRT-PCR技术验证了转录组数据分析结果的可靠性；同时，实验证实了甲吡唑对松材线虫幼虫的发育、寿命、雌虫产卵率以及线虫卵的孵化率都具有显著的干扰效果。
本文通过对adh-1的基因功能和甲吡唑的作用机制进行研究，初步确定adh-1基因参与调控松材线虫运动、繁殖等生理活动，对松材线虫的扩散与增殖影响较大，有望成为控制松材线虫的一个靶点；甲吡唑作为adh-1基因编码的醇脱氢酶抑制剂，在μM量级就对松材线虫的一些关键基因表达产生显著影响，从而引起代谢紊乱而呈现明显的杀线活性，使甲吡唑及其衍生物有望成为一种新型的杀线药物。本文研究结果对于深入了解松材线虫发育和致病的分子机理有一定的参考作用，对于松萎蔫病的防控药物的研发也提供了一种新的选择。