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急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是骨髓造血干/祖细胞不同成熟阶段分化受阻,进而阻碍正常造血的一种高度异质性血液肿瘤。其标准诱导化疗方案已经近50年未曾改变过,目前仍是一种预后较差的急性白血病类型,5年生存率仅20%左右,多数AML患者化疗耐药或最终复发。大量研究发现CD123广泛高表达在AML干/祖细胞(leukaemia stem cells,LSCs)表面,而低表达或不表达在正常造血干/祖细胞(hematopoietic stem/progenitor cells,HSPCs)中,且已证实CD123高表达与AML不良预后有关,因此,CD123已成为AML嵌合抗原受体(chimeric antigen receptors,CARs)T细胞免疫治疗新的理想靶点。本研究第一部分我们回顾性分析了CD123在初诊AML(非APL)患者中的表达分布及与生存预后的关系,探讨表达CD123的AML患者是否更易诱导化疗失败及伴有更差的生存预后,从而为靶向CD123的CART细胞免疫治疗AML提供理论基础。本研究第二部分则是通过构建靶向CD123的CAR慢病毒载体,制备具有高转染效率的CART123细胞,体外试验验证CART123对CD123~+AML原代细胞的细胞毒性作用,明确CART123细胞的有效性,为临床难治复发CD123~+AML患者提供新的治疗选择。第一部分CD123在急性髓系白血病细胞中的表达及预后价值研究研究目的回顾性分析CD123在137例初诊AML患者中的表达分布及与患者生存预后的关系。研究方法回顾性分析2012年1月至2015年12月我院血液科收治的137例初诊AML(M3除外)患者CD123表达情况,收集患者基本临床资料,包括年龄、性别、初诊白细胞计数、初诊骨髓原始细胞比例、细胞遗传学及分子生物学异常、是否移植、是否达CR1以及CD123表达。初诊时多参数流式细胞术检测CD123表达占骨髓白血病细胞群≥20%定义为阳性。使用SPSS 21软件进行数据统计分析,所有计数资料采用“频数”(%)表示,计量资料采用“中位数”表示,两组间比较采用卡方检验、Mann-Whitney U检验或Fisher确切概率法,生存资料分析采用Kaplan-Meier法,生存率的比较采用log-rank检验,完全缓解率(CR1)采用非条件Logistic回归分析,生存分析采用COX比例风险模型进行单因素和多因素分析,所有多变量回归分析均列出OR或HR以及95%的置信区间用于风险评估,所有检验均为双侧检验,统计检验结果P<0.05为差异具有统计学意义。结果1、137例初诊AML患者中,男性70例(51.2%),女性67例(48.9%),中位年龄46岁(13-72岁),其中CD123~+组84例(61.3%),CD123~-组53例(38.9%),按FAB/WHO分型M1-M6中CD123表达率分别为60.0%(3/5)、48.5%(16/33)、70.8%(34/48)、68.4%(26/38)、50.0%(4/8),未分类者20.0%(1/5);其中M1、M4、M5的CD123表达阳性率相对较高,M2、M6表达稍偏低,M4与M2比较有明显统计学差异(P=0.042)。所有病例根据细胞遗传学及分子学异常进行危险分组,分别为预后良好组(28例)、预后中等组(74例)和预后不良组(35例),结果显示三组CD123表达无明显统计学差异;2、分析患者临床参数及常见突变基因与CD123表达的相关性,结果发现初诊高白细胞计数(P=0.001)、CR1(P=0.027)与CD123表达明显相关,其余临床指标均与CD123表达无明显相关性;3、疗效分析显示,137例AML患者总CR1率为62.0%(85/137),CD123~+组与CD123~-组CR1率分别为54.8%(46/84)、73.6%(39/53),差异有明显统计学意义(P=0.027);Logistic回归模型分析显示,初诊骨髓原始细胞比例(P=0.021)及CD123表达(P=0.024)是AML患者CR1的独立危险因素;至随访终点,完全缓解患者共有52例复发,总复发率46.8%(52/111),CD123~+组与CD123~-组分别为50.8%(32/63)、41.7%(20/48),两组复发率比较无明显统计学差异(P=0.340);4、生存分析显示,CD123~+组和CD123~-组相比有明显更短的OS(P=0.015),但两组DFS比较无明显统计学差异(P=0.086);多因素分析显示CD123表达是影响AML患者OS的独立不良预后因素。将所有患者进行危险分层后,发现预后中等组中CD123~+组和CD123~-组比较OS(P=0.035)及DFS(P=0.029)均明显降低。进一步将患者按年龄分组后,发现年龄≤50岁组CD123表达是患者预后的独立危险因素,两组OS(P=0.003)和DFS(P=0.006)比较有明显统计学差异。结论1、CD123在初诊AML患者中广泛高表达,其中M4型CD123表达百分比最高。初诊高白细胞计数与CD123表达呈正相关;2、CD123表达是影响AML患者CR1的独立危险因素,可用来评估患者治疗疗效;3、CD123表达患者有更差的OS,但对患者的DFS并无明显影响;4、将全部患者按危险分层及年龄分组后,发现在预后中等组及年龄≤50岁组中CD123表达能更好地预测患者生存预后。第二部分靶向CD123的嵌合抗原受体T细胞体外抗白血病作用研究研究目的构建靶向CD123的CAR慢病毒载体,制备具有高转染效率的CART123细胞,体外试验验证CART123对CD123~+AML原代细胞的细胞毒性作用,明确CART123的有效性,为临床治疗CD123~+难治复发AML患者提供试验基础。研究方法采用Ficoll密度梯度离心法分离健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC),CD3/CD28+IL-2激活2-3天,转染以4-IBB作为共刺激分子的CD123-CAR慢病毒,体外扩增8天后,q PCR检测转染效率、流式细胞术检测(FACS)细胞表型,流式Count Bright磁珠绝对计数法验证CART123体外靶向杀伤能力,流式细胞术检测效靶细胞共培养后CD107α释放及细胞因子分泌情况。结果1、成功构建CD123T28z和CD123TBBz两种结构的CD123 CAR慢病毒载体,CD123TBBz能有效转染激活的健康供者T淋巴细胞细胞,获得高转染效率及合适CD4/CD8细胞亚群比例的CART123细胞;2、CART123与CD123~+AML原代细胞体外共培养后表现出显著的CD107α释放和细胞因子分泌,并且能有效发挥杀伤靶细胞的能力。结论体外验证了我们的CART123细胞具有高转染效率、高扩增倍数以及显著的靶向杀伤CD123~+AML原代细胞的能力。这些研究结果提示CART123可能是复发难治CD123~+AML患者新的细胞免疫治疗方法。