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由过度磷酸化tau蛋白聚集形成的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFTs)是阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)和与17号染色体相关的额颞叶痴呆与帕金森病(Parkinson’s disease, PD)等tau相关疾病的主要神经病理学特征之一。但是到目前为止,导致tau蛋白过度磷酸化及形成NFTs的机制尚未完全阐明。不仅tau蛋白的磷酸化,而且其泛素化也可促进NFTs的形成。泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system, UPS)通过E3泛素连接酶可将磷酸化的tau蛋白泛素化,同时蛋白酶体活性在tau相关疾病中降低,表明UPS可能影响tau蛋白的过度磷酸化。此外,糖原合酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)和蛋白激酶B(protein kinase B, PKB/Akt)也在tau蛋白的异常磷酸化中起关键作用,Akt是GSK-3β的上游激酶,且热休克蛋白90(heat shock protein 90, Hsp90)与Akt两者之间结合程度的变化可以调节Akt蛋白含量和活性改变。因此本文用稳定表达人tau441异构体的人肾母瘤细胞株(human embryonic kidney 293 cells, HEK293/tau441)为基本材料,用20S proteasome特异性抑制剂lactacystin和蛋白质合成抑制剂放线菌酮(cycloheximide, CHX)共同处理细胞24 h,通过免疫印迹、免疫荧光和免疫共沉淀技术检测蛋白酶体活性抑制对tau蛋白相关位点磷酸化、蛋白激酶GSK-3β、Akt和热休克蛋白的影响以及蛋白酶体与GSK-3β和蛋白酶体与Akt之间的相互作用关系,以探讨蛋白酶体活性抑制导致tau蛋白过度磷酸化的可能机制,结果如下：(1)蛋白酶体活性抑制对tau蛋白总量和磷酸化程度的影响蛋白酶体活性抑制可诱导tau蛋白总量增加,tau-Thr231, Ser396, Thr205和Ser195/198/199/202位点磷酸化程度增加,提示tau蛋白和磷酸化tau蛋白可能都是蛋白酶体的降解底物。但蛋白酶体活性抑制后tau-Ser214位点磷酸化程度下降。(2)蛋白酶体与GSK-3β之间的关系GSK-3β是调节tau蛋白磷酸化的主要激酶之一,而蛋白酶体活性抑制后引起的tau蛋白过度磷酸化修饰的位点(Thr231, Ser396, Thr205和Ser195/198/199/202)均是GSK-3β的调节位点,因此为了阐述蛋白酶体活性抑制引起的tau蛋白磷酸化程度增加的机制,本实验检测了该体系中GSK-3β含量和活性的改变。结果发现蛋白酶体活性抑制导致GSK-3β-Ser9位点磷酸化程度降低,由于此位点磷酸化程度与GSK-3β活性呈负相关关系,因此该结果表明蛋白酶体活性抑制使GSK-3β活性升高,这与蛋白酶体活性抑制使tau-Thr231, Ser396, Thr205和Ser195/198/199/202位点过度磷酸化保持一致,表明蛋白酶体可通过调节GSK-3p活性间接调节tau蛋白磷酸化。同时也检测到蛋白酶体活性抑制使GSK-3p蛋白含量升高,且免疫荧光和免疫共沉淀技术检测发现,细胞内20S proteasome和GSK-3p两者之间有共定位和共沉淀关系,提示细胞内GSK-3p可能是蛋白酶体的降解底物。(3)蛋白酶体与Akt之间的关系Akt既是GSK-3p的上游激酶也是tau-Ser214位点磷酸化的主要调节激酶,因此本研究中进一步检测了蛋白酶体活性抑制对Akt蛋白激酶含量和活性的影响。结果发现蛋白酶体活性被抑制时,Akt的Ser473和Thr308位点磷酸化程度随着lactacystin浓度的升高而降低,Akt的Ser473和Thr308是Akt的活性调节位点,这两个位点的磷酸化程度降低表明Akt的活性下调,这与抑制蛋白酶体活性使GSK-3β-Ser9和tau-Ser214位点磷酸化程度降低保持一致,提示蛋白酶体活性抑制可通过调节Akt的活性间接调节tau蛋白磷酸化。研究还发现当蛋白酶体活性受到抑制时,细胞内Akt蛋白含量升高,同时免疫荧光和免疫共沉淀技术显示20Sproteasome和Akt两者在细胞内有共定位和共沉淀关系,该结果说明Akt也可能是蛋白酶体的降解底物。(4)蛋白酶体活性抑制对热休克蛋白的影响Hsp90与Akt两者结合程度的改变可以调节Akt活性,因此为了进一步探测蛋白酶体活性抑制引起Akt活性下调的机制,本实验检测了细胞内蛋白酶体活性抑制对Hsp90和Hsp70含量的影响。结果发现,抑制蛋白酶体活性使细胞内热休克蛋白家族成员Hsp90和Hsp70含量升高。因此推测当蛋白酶体降解系统被阻碍时,异常聚集的蛋白会刺激细胞应激系统导致细胞内热休克蛋白迅速产生,恢复这些聚集蛋白的正常功能。但蛋白酶体活性抑制诱导的含量增加的Hsp90与Akt结合程度如何改变,还需进一实验研究。综上所述,蛋白酶体活性抑制对tau蛋白磷酸化的调节可通过下列途径进行：①蛋白酶体可直接降解tau蛋白和磷酸化tau蛋白；②蛋白酶体可通过调节GSK-3p和Akt活性间接调节tau蛋白磷酸化；③蛋白酶体活性抑制可诱导Hsp90和Hsp70含量增加。蛋白酶体活性抑制导致的Hsp90含量增加可能参与调节Akt活性,但如何调节需进一步实验研究。