论文部分内容阅读
动脉粥样硬化(AS)是一种慢性进行性疾病,是心血管疾病发生的病理基础,可于大、中动脉血管中形成。炎症反应贯穿AS发展的始终,抗炎治疗是目前防治AS重要治疗方法。自噬是细胞内存在的一种“自食”现象,对维持细胞内环境稳定和正常的生理功能十分重要。巨噬细胞为AS斑块中的主要炎性细胞,巨噬细胞的自噬功能在AS的防治中发挥重要作用。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(PKB/Akt)是一种重要的信号通路,可以调节细胞自噬,从而影响AS进程。小檗碱(BBR)可从黄连、黄柏等植物中提取,是一种异喹啉类生物碱,可通过调脂、抑制炎症反应、抗氧化应激、改善血管内皮功能障碍等多途径防治AS。BBR是否能通过调控PI3K/Akt通路来促进巨噬细胞自噬,减轻炎症反应,有待深入研究。目的:本研究用脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞炎症反应建立细胞模型,探讨BBR是否能够通过调控PI3K/Akt信号通路,促进巨噬细胞自噬,减轻炎症反应,为BBR防治AS提供潜在的理论依据。方法:1.本研究通过分离Apo E-/-小鼠RAW 264.7巨噬细胞,以LPS诱导RAW 264.7巨噬细胞炎症反应建立细胞模型。2.细胞的分组与处理:共分为7组:(1)空白对照组:只加1640细胞培养基;(2)LPS组:加LPS 200μg·ml-1培养48 h;(3)PI3K-si RNA组:30 nmol·L-1PI3K-si RNA预处理1 h,加入BBR 100μmol·L-1预处理1 h后,后再加LPS 200μg·ml-1共培养48 h;(4)Akt-si RNA组:30 nmol·L-1Akt-si RNA预处理1 h,加入BBR 100μmol·L-1预处理1 h后,后再加LPS 200μg·ml-1共培养48 h;(5)BBR低剂量组:加入BBR 25μmol·L-1预处理1 h后再加LPS 200μg·ml-1培养48 h;(6)BBR中剂量组:加入BBR 50μmol·L-1预处理1 h后再加LPS 200μg·ml-1培养48 h;(7)BBR高剂量组:加入BBR 100μmol·L-1预处理1 h后再加LPS 200μg·ml-1培养48 h。3.检测方法及指标:用CCK-8检测巨噬细胞的活力;免疫荧光标记自噬;透射电镜观察RAW 264.7巨噬细胞自噬小体的数量;酶联免疫吸附测定(ELISA)检测巨噬细胞培养液中hs-CRP、IL-6、TNF-α水平;蛋白质免疫印迹(Western blot)检测巨噬细胞p-PI3K、p-Akt、Beclin-1、LC3-II、IL-6、TNF-α、hs-CRP蛋白表达。结果:1.BBR对巨噬细胞活力的影响:与空白对照组比较,LPS组巨噬细胞活力显著降低(P<0.05);与LPS组比较,BBR中剂量组、BBR高剂量组巨噬细胞活力显著升高(P<0.05),BBR低剂量组无显著差异(P>0.05);与BBR高剂量组比较,PI3K-si RNA组及Akt-si RNA组巨噬细胞活力显著降升高(P<0.05)。2.BBR对巨噬细胞Beclin-1、LC3-II荧光表达的影响:(1)各组巨噬细胞Beclin-1荧光表达水平比较:与空白对照组比较,LPS组巨噬细胞Beclin-1荧光表达显著降低(P<0.05);与LPS组比较,BBR中剂量组、BBR高剂量组巨噬细胞Beclin-1荧光表达显著升高(P<0.05),BBR低剂量组无显著差异(P>0.05);与BBR高剂量组比较,PI3K-si RNA组及Akt-si RNA组巨噬细胞Beclin-1荧光表达显著升高(P<0.05)。(2)各组巨噬细胞LC3-II荧光表达水平比较:与空白对照组比较,LPS组巨噬细胞LC3-II荧光表达显著降低(P<0.05);与LPS组比较,BBR中剂量组、BBR高剂量组巨噬细胞LC3-II荧光表达显著升高(P<0.05),BBR低剂量组无显著差异(P>0.05);与BBR高剂量组比较,PI3K-si RNA组及Akt-si RNA组巨噬细胞LC3-II荧光表达显著升高(P<0.05)。3.BBR对巨噬细胞自噬小体数量的影响:与空白对照组比较,LPS组巨噬细胞自噬小体数量显著减少(P<0.05);与LPS组比较,BBR中剂量组、BBR高剂量组巨噬细胞自噬小体数量显著增加(P<0.05),BBR低剂量组无显著差异(P>0.05);与BBR高剂量组比较,PI3K-si RNA组及Akt-si RNA组巨噬细胞自噬小体数量显著增加(P<0.05)。4.BBR对巨噬细胞培养液中IL-6、TNF-α、hs-CRP水平的影响:与空白对照组比较,LPS组巨噬细胞培养液中IL-6、TNF-α、hs-CRP水平显著增加(P<0.05);与LPS组比较,BBR中剂量组、BBR高剂量组巨噬细胞培养液中IL-6、TNF-α、hs-CRP水平显著降低(P<0.05),BBR低剂量组无显著差异(P>0.05);与BBR高剂量组比较,PI3K-si RNA组及Akt-si RNA组巨噬细胞培养液中IL-6、TNF-α、hs-CRP水平显著降低(P<0.05)。5.BBR对巨噬细胞p-PI3K、p-Akt、Beclin-1、LC3-II、IL-6、TNF-α、hs-CRP蛋白表达的影响:(1)各组巨噬细胞p-PI3K、p-Akt蛋白表达水平比较:与空白对照组比较,LPS组巨噬细胞p-PI3K、p-Akt蛋白表达显著增加(P<0.05);与LPS组比较,BBR中剂量组、BBR高剂量组巨噬细胞p-PI3K、p-Akt蛋白表达显著降低(P<0.05),BBR低剂量组无显著差异(P>0.05);与BBR高剂量组比较,PI3K-si RNA组及Akt-si RNA组巨噬细胞p-PI3K、p-Akt蛋白表达显著降低(P<0.05)。(2)各组巨噬细胞Beclin-1、LC3-II蛋白表达水平比较:与空白对照组比较,LPS组巨噬细胞Beclin-1、LC3-II蛋白表达显著降低(P<0.05);与LPS组比较,BBR中剂量组、BBR高剂量组巨噬细胞Beclin-1、LC3-II蛋白表达显著增加(P<0.05),BBR低剂量组无显著差异(P>0.05);与BBR高剂量组比较,PI3K-si RNA组及Akt-si RNA组巨噬细胞Beclin-1、LC3II蛋白表达显著增加(P<0.05)。(3)各组巨噬细胞IL-6、TNF-α、hs-CRP蛋白表达水平比较:与空白对照组比较,LPS组巨噬细胞IL-6、TNF-α、hs-CRP蛋白表达显著增加(P<0.05);与LPS组比较,BBR中剂量组、BBR高剂量组巨噬细胞IL-6、TNF-α、hs-CRP蛋白表达显著降低(P<0.05),BBR低剂量组无显著差异(P>0.05);与BBR高剂量组比较,PI3K-si RNA组及Akt-si RNA组巨噬细胞IL-6、TNF-α、hs-CRP蛋白表达显著降低P<0.05)。结论:1.BBR可显著减轻LPS对巨噬细胞活力的抑制作用,并显著降低由LPS诱导巨噬细胞分泌IL-6、TNF-α、hs-CRP水平及巨噬细胞IL-6、TNF-α、hs-CRP蛋白表达,减轻炎症反应。2.BBR可显著增加由LPS诱导巨噬细胞Beclin-1、LC3-II荧光和蛋白表达,并显著增加巨噬细胞自噬小体数量,促进巨噬细胞自噬。3.BBR可显著降低巨噬细胞p-PI3K、p-Akt蛋白表达,抑制PI3K/Akt信号通路,促进巨噬细胞自噬,抑制炎症反应。4.BBR能剂量依赖性地抑制PI3K/Akt信号通路,促进巨噬细胞自噬,减轻炎症反应。