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脑缺血、心肌缺血等造成的细胞缺血性损伤是人类许多重大疾病的细胞病理基础,细胞缺血性损伤包括了细胞缺氧性损伤和细胞缺糖损伤两个基本病理变化。 大鼠的grp75基因于1995年从脑缺血的cDNA文库克隆获得,在心脏、脑、脾脏、肺等多种组织中有构成性表达。已有的生物信息学资料显示grp75前体带有一段线粒体蛋白的信号肽。同时国内外的研究显示grp75作为分别定位于胞质和线粒体内的分子伴侣协助线粒体蛋白质的转运,提高细胞对应激反应的耐受性。本实验室的前期研究表明当细胞受到缺糖损伤时grp75呈上调表达,而grp75过表达的细胞对一定强度的缺糖损伤有明显的改善功能。为寻找一种安全性高的grp75表达增强剂,使grp75对细胞缺糖损伤保护作用通过安全、可操作性强的手段得以实施,本实验本文以PC12细胞为模型,检测了一种人体调节必需氨基酸——谷氨酰胺对细胞内grp75表达的调节作用。用免疫细胞化学法、Western blot印迹法检测细胞中grp75的蛋白含量,结果表明谷氨酰胺可以上调grp75的表达,特别是对缺糖细胞的上调作用更显著;但这种上调作用与谷氨酰胺的作用浓度和作用时间并未显示出有明显的关系。以原位杂交、和RT-PCR法检测谷胺酰胺作用下PC12细胞内grp75的mRNA水平的,结果显示谷氨酰胺作用下细胞内grp75的mRNA含量显著上升,无糖培养的细胞经谷氨酰胺作用后这一上调作用更明显。谷氨酰胺作用后细胞内grp75mRNA水平的这种变化,提示谷氨酰胺可能通过调节grp75的转录而使之表达增强。 为观察谷氨酰胺对细胞缺糖损伤和动物脑缺血损伤的保护作用及其与grp75细胞保护作用的相关性,以无糖培养PC12细胞建立细胞缺糖损伤模型,以大鼠大脑中动脉线栓法建立动物脑缺血模型。MTT法、流式细胞法检测细胞凋亡率、细胞线粒体跨膜电位检测等方法观察谷胺酰胺了对损伤缺糖损伤的细胞模型作用,谷氨酰胺作用能使细胞在缺糖刺激下存活率增加、凋亡率降低,而跨膜电位也未呈现去极化的变化,谷氨酰胺对细胞缺糖的这一保护作用与细胞grp75过表达后所显示的保护作用一致;MTT检测显示grp75低表达的细胞在含谷氨酰胺的无糖培养液中培养24h,其相比存活率明显低于经含谷氨酰胺的无糖培养液培养的对照组细胞,证实了谷氨酰胺对细胞缺糖损伤的保护部分是通过调节grp75表达而起作用的。为了进一步了解谷氨酰胺对细胞缺糖损伤的保护的机制,以Fluo3/AM为荧光探针,激光共聚焦显微镜观察了细胞内钙离子浓度的保护,结果显示缺糖早期,谷氨酰胺呈现出抑制钙离子内流的作用。对模型动物的神经功能评分和脑组织切片的观察都显示经谷氨酰胺处理的实验动物的脑组织损伤程度较轻,表明谷氨酰胺对缺血性损伤的实验动物模型的脑组织有一定保护作用。