论文部分内容阅读
本实验应用脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导恶性胶质瘤细胞系LN229细胞株建立胶质细胞炎性激活的模型，观察在SHH通路阻断剂cyclopamine阻断SHH通路的情况下，LN229细胞激活及炎症因子的表达。并一步观察LPS刺激下阻断SHH通路对胶质-神经元共培养下神经细胞的保护作用。最后观察LPS刺激下阻断SHH通路对LN229细胞帕金森相关基因Nurr1的表达的影响，为临床上治疗帕金森病提供新策略。本实验分三部分：第一部分LN229细胞炎症激活模型的建立及阻断SHH通路对炎症因子表达的影响目的：应用LPS刺激LN229细胞，建立胶质细胞激活的细胞模型，在此基础上探讨cyclopamine阻断SHH通路对胶质激活的影响。方法：运用CCK-8法检测所用浓度LPS及cyclopamine对LN229的细胞毒性；实时荧光定量PCR检测不同时间点LPS诱导下IL-1β mRNA的表达变化以确定LPS使用浓度。根据以上实验结果运用LPS刺激LN229细胞建立胶质细胞激活模型，实时荧光定量PCR检测炎症因子iNOS、TNFα、IL-1β及胶质细胞激活相关基因caspase8、caspase3的mRNA的表达。Cyclopamine预处理细胞12小时后LPS刺激LN229细胞6小时后，实时荧光定量PCR检测炎症因子iNOS、TNFα、IL-1β及胶质细胞激活相关基因caspase8、caspase3的mRNA的表达。结果：CCK-8实验结果显示，在所用浓度LPS及cyclopamine处理细胞24小时内，LPS处理组与空白对照组对比未对细胞产生明显毒性(P>0.05)，但cyclopamine处理24小时与空白对照组细胞存活率降低(P<0.05)。实时荧光定量PCR结果显示LPS处理细胞6小时后炎症因子IL-1β表达和空白对照组比有明显差异(P<0.01)。在胶质细胞炎性激活的模型建立中，LPS处理组与对照组相比炎症因子iNOS、TNFα、IL-1β显著增高，且胶质细胞激活相关基因caspase8、caspase3mRNA也表达上升。同时在LPS刺激条件下，cyclopamine组与对照组相比，炎症因子iNOS、TNFα、IL-1β及caspase8、caspase3mRNA表达进一步上升。结论：1. LPS能诱导恶性胶质瘤细胞LN229细胞炎症因子表达；2. LPS刺激LN229细胞能建立胶质细胞激活细胞模型；3. cyclopamine阻断SHH通路能加强LPS刺激下LN229细胞炎症因子的表达。第三部分cyclopamine对脂多糖诱导下LN229细胞中帕金森病相关基因Nurr1的表达的影响目的：研究cyclopamine对脂多糖诱导的胶质细胞激活模型中Nurr1基因表达的影响，进一步探讨其神经损伤的机制。方法：在LPS刺激LN229细胞的条件下，运用实时荧光PCR检测cyclopamine阻断SHH通路对Nurr1基因mRNA表达的影响；运用western blotting检测阻断SHH通路对Nurr1基因蛋白表达的影响。结果：LPS刺激下LN229细胞Nurr1基因mRNA、蛋白表达上调，cyclopamine能第二部分阻断SHH信号通路增强LPS诱导下神经细胞的损害目的：探讨cyclopamine阻断SHH通路对LPS刺激下，神经元-胶质细胞共培养条件下，神经元损伤的影响。方法：采用胚胎大鼠原代细胞培养，分别建立神经元-胶质细胞、胶质细胞培养体系。LPS、cyclopamine处理各体系细胞，CCK法观察其对各组细胞存活率的影响。结果：在胶质细胞培养体系中，LPS组与空白对照组相比细胞存活率未见明显改变(P>0.05)，cyclopamine组与空白对照组相比细胞存活率也未见明显改变(P>0.05)；在神经元-胶质细胞培养体系中，LPS组与空白对照组相比细胞存活率有明显改变(P<0.05)，且LPS/cyclopamine联合组与LPS组相比有明显改变(P<0.05)，LPS/cyclopamine联合组与空白对照组比有显著性差异(P<0.01)。结论：1.LPS能损伤神经元-胶质细胞共培养下的神经细胞；2. Cyclopamine阻断SHH通路能加强LPS刺激下神经细胞的损伤。进一步加强LPS引起的Nurr1基因表达的上调。结论：1. LPS能诱导LN229细胞建立胶质细胞激活细胞模型。2. Cyclopamine能增加LPS诱导LN229细胞炎症因子的释放。3. Cyclopamine能增加LPS刺激下神经元-胶质细胞培养体系中神经元细胞的死亡。4. Cyclopamine促进LPS诱导下LN229细胞炎症因子释放，不是通过抑制Nurr1基因的表达实现的。