目的:热休克蛋白(Hsp)是细胞针对不同类型的应激时产生的具有保护细胞内稳态的一类分子伴侣。哺乳动物Hsp可根据其分子量分为几个亚家族,即Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40、Hsp27等。HSP90蛋白的两个基因编码分别是Hsp90α和Hsp90β,两者氨基酸序列有80%的同源,并一起构成正常细胞中总蛋白质的2-3%,HSP90α的表达可被应激刺激诱导,而HSP90β在细胞中持续稳定表达。Hsp90α是调控生理和病理条件下细胞内稳态的主要分子伴侣,参与多种疾病的发生。Hsp90α作为多个疾病(如老年痴呆,心血管疾病,恶性肿瘤等)治疗药物潜在靶点已受到广泛的关注。在AD病理过程中,Hsp90α被诱导表达,并结合过度磷酸化的tau蛋白和Aβ蛋白,参与tau和Aβ纤维的形成,级联放大老年斑和tau蛋白积聚,从而促进AD的发生发展。Hsp90α抑制剂不但防止tau聚集而且溶解已经聚合的tau,在Aβ的加工和清除中也起重要作用,目前认为Hsp90α抑制剂对Aβ诱导的毒性具有抑制作用,能够挽救Aβ诱导的小鼠认知障碍,抵御tau蛋白和Aβ蛋白介导的炎症损伤。因此,Hsp90α可能是治疗AD病人的一个潜在药物靶点。针对Hsp90α的化学抑制剂已有多种,有些已用于肿瘤治疗的二期临床试验,这为Hsp90α作为药物靶向奠定了基础,但是这些化学药物是否能通过血脑屏障,是否对正常神经细胞或神经支持细胞具有毒性等还没有细致的评价。多肽作为靶向药物越来越受到重视,如康柏西普多肽药物治疗AMD等。多肽通过与靶向蛋白的特异作用,可激活或抑制靶向蛋白的功能,这种方式具有特异性强,结合能力高,在细胞内的靶向效应高等特点。因此,我们提出靶向Hsp90α蛋白多肽药物研究课题,噬菌体7肽库是目前常用的靶向肽筛选库。因此我们提出一个假设,从噬菌体七肽库筛选Hsp90α亲和性多肽并对其进行体外Hsp90α结合活性鉴定。目的是寻找能结合并调控Hsp90α蛋白活性的多肽,为Hsp90α靶向药物提供更多的选择。方法:(1)重组质粒pGEX-6P-1/Hsp90α的构建:根据NCBI公布的全长Hsp90α的c DNA序列设计引物,通过PCR扩增基因片段,分别对Hsp90α基因片段和质粒pGEX-6P-1经Sma1和Xho1双酶切。目的片段和载体酶连,重组载体转化大肠杆菌DH5α,进行单克隆筛选,对阳性克隆菌扩增、测序、鉴定,证明了重组质粒pGEX-6P-1/Hsp90α构建成功。(2)体外表达重组GST-HSP90a蛋白:将pGEX-6P-1/Hsp90α转化表达细菌BL21,在IPTG诱导下,表达HSP90α蛋白,SDS-PAGE检测Hsp90α蛋白的表达,Western blot鉴定目的蛋白。(3)Hsp90α蛋白的纯化:应用GST-glutathione sepharose 4b beads介导的亲和层析方法纯化GST-Hsp90α蛋白,超滤器浓缩和透析蛋白,得到纯度较高的GST-Hsp90α蛋白。(4)筛选与Hsp90α结合的多肽:GST-Hsp90α蛋白包备在96孔板上,将稀释好的多肽噬菌体库加入96孔板进行结合试验,洗涤未结合的噬菌体,将结合的噬菌体,在细菌中扩增,以此方法对多肽库进行3轮的筛选。提取阳性噬菌体DNA,测序鉴定阳性多肽。(5)phage ELISA体外测定多肽与Hsp90α的亲和性。结果:1.成功构建了重组质粒pGEX-6P-1/Hsp90α。2.获得2.8mg/ml纯度较高的GST-Hsp90α蛋白。3.以Hsp90α为靶蛋白,经过3轮的噬菌体肽库筛选,得到25个富集的噬菌体克隆,phage ELISA鉴定了4个噬菌体克隆与Hsp90α有很好的亲和性。结论:应用噬菌体展示的7肽库可筛选到Hsp90α的亲和性多肽。为下一步进行多肽调控HSP90a分子伴侣活性以及对AD疾病治疗提供了前期研究基础。