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本论文包括两个相对独立的课题研究内容,一是操纵精准型非同源末端连接(non homologous end joining,NHEJ)实现 CRISPR/Cas9 介导的高效精准删除;二是基于CRISPR/Cas9基因敲除技术建立小鼠原发性肝癌模型。课题一:前期研究中发现在I-SceI诱导DNA双链断裂(double strand break,DSB)修复中精准型NHEJ(accurate NHEJ,accNHEJ)占据总NHEJ 一半以上比例,我们推测CRISPR/Cas9诱导的NHEJ也可能大部分是精准型NHEJ。本研究中,利用配对sgRNA技术与Cas9在内源基因组上诱导两个临近DSB损伤,并评估了随后修复中CRISPR/Cas9诱导的NHEJ,发现在人和小鼠基因组中发生的NHEJ也有50%左右属于精准型NHEJ。利用该技术进一步研究发现类似于I-SceI诱导的NHEJ调控,NHEJ核心因子XRCC4推动了 CRISPR/Cas9诱导的NHEJ修复进程;与XRCC4敲除时相比较,XRCC4在其中抑制突变型NHEJ,而且突变型NHEJ中删除插入(insertion/deletion,indel)长度变短、徽同源序列利用率低,因此精准型NHEJ频率高;这一结果表明配对sgRNA技术提供了 一种不依赖外源报告即可定量分析体内NHEJ的方法。基于CRISPR/Cas9诱导的精准型NHEJ发生频率较高这一事实,我们还分析了配对sgRNA间距及位置关系对精准型NHEJ的影响,并利用配对sgRNA技术提高基因敲除效率(out-frame deletion),实现在读码框内对基因结构域的精准编辑(in-frame deletion)。我们还发现抑制DSB末端加工因子CtIP可以提高配对sgRNA介导的精准型NHEJ比例,这提供了一个有助于精准编辑的策略。此研究一方面为今后研究NHEJ提供了一种便捷可靠的分析方式,不但可以对精准型NHEJ做出定量分析,还可以对NHEJ修复中断裂末端接口的规律做出评估。另一方面,配对sgRNA技术也提高了 CRISPR/Cas9系统在精准删除编辑中的可控性和效率,为精准基因编辑提供了新思路和新方法。课题二:原发性肝癌是一个多因素诱发、多基因突变参与、高度异质性恶性肿瘤。肝癌基因组学研究为我们提供了大量在肝癌发生发展过程中突变基因信息和潜在分子机制,但是其中的驱动突变或驱动突变组合并不十分明确,驱动突变间的相互联系也不清楚,如何把这些信息转化到临床应用依然缺乏机制上的支撑。因此,我们构建了一个含有34个肝癌相关抑癌基因的sgRNA文库,与Cas9表达质粒一起注入小鼠肝脏,利用CRISPR/Cas9技术在肝脏细胞中同时编辑多个抑癌基因位点,成功构建包含肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)、肝内胆管细胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)和混合细胞癌等病理类型在内的小鼠原发性肝癌模型。基于只有特定突变或突变组合才能推动肝脏细胞转化为肝癌细胞这一假设,我们预测小鼠肝脏肿瘤形成过程中会选择保留特定基因突变或突变组合。通过肿瘤组织和原代细胞株靶序列深度测序分析,发现保留的特定基因突变或突变组合尽管有一定规律,但比预期要复杂许多,这可能与肝脏肿瘤基因组不稳定性、肝癌细胞多倍体现象及肿瘤异质性相关。我们将进一步采用单细胞测序进行探索。本研究不仅为肝癌研究提供了一种快速有效的建模方式,而且将.有助于阐明肝癌发生发展分子机制。