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背景:结直肠癌(Colorectal Cancer,CRC)是一种起源于结直肠黏膜上皮的恶性肿瘤,该类肿瘤细胞易发生转移。研究表明Gridin表达于多种恶性增殖肿瘤组织,其表达加速了肿瘤增殖、侵蚀和转移的进程,同时还可调控抑制肿瘤细胞凋亡自噬。但Girdin蛋白对CRC细胞中恶性行为的作用和机制尚未见研究。目的:为探讨Girdin蛋白在CRC发生发展中的生物学功能和机制,本论文通过RNAi技术下调细胞中Girdin蛋白表达,考察Girdin蛋白表达下调对细胞的增殖凋亡、迁移侵袭活动及其相关信号通路的影响,最后验证Girdin蛋白在体内环境下对肿瘤细胞恶性行为的影响。方法:1.构建Girdin表达下调稳转细胞系采用Western Blot方法在人CRC细胞系Caco-2,HCT-15,Lo Vo和DLD-1中筛选Girdin蛋白高表达细胞系用于后续研究。根据Girdin基因序列设计sh RNA及其阴性对照sh RNA序列,构建sh RNA表达载体Girdin-p GCH1/Neo和NC-p GCH1/Neo,并采用转染试剂Lipofectamine进行细胞转染,筛选NC和Girdin si RNA两种稳转细胞系。采用荧光显微镜、流式细胞仪、QPCR和Western Blot方法进行Girdin表达鉴定。2.Girdin蛋白表达下调对CRC肿瘤细胞增殖及凋亡的影响采用MTT法分别检测Lo Vo细胞、NC细胞及Girdin si RNA细胞培养12 h、24 h、48 h、72 h和96 h后的细胞增殖活性;采用流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期分布及细胞凋亡情况;采用Western Blot方法检测细胞中凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2。3.Girdin蛋白表达下调对肿瘤细胞迁移和侵袭能力的影响采用细胞划痕实验考察Lo Vo细胞、NC细胞及Girdin si RNA细胞的迁移能力;Transwell实验检测各细胞的侵袭能力;采用Western Blot方法检测细胞中迁移侵袭相关蛋白的表达,深入探讨Girdin蛋白在肿瘤细胞迁移侵袭过程中的功能。4.Girdin与JAK/STAT信号通路的关系采用Western Blot方法检测Lo Vo细胞、NC细胞和Girdin si RNA细胞中JAK/STAT信号通路蛋白的表达及磷酸化水平和通路相关炎性因子水平;用JAK抑制剂LY2784544处理NC细胞和Girdin si RNA细胞以考察阻断JAK/STAT通路后Girdin蛋白下调对细胞侵袭能力的影响;Transwell实验检测LY2784544处理的NC细胞和Girdin si RNA细胞的侵袭能力。5.Girdin蛋白表达下调对肿瘤细胞在体内增殖活性的影响BALB/c裸鼠分别接种Lo Vo,NC和Girdin si RNA细胞,考察各细胞体内增殖能力,并采用TUNEL法检测肿瘤组织中细胞的凋亡情况,Western Blot法检测肿瘤组织中侵袭相关蛋白表达情况。结果:1.Western Blot方法筛得Lo Vo细胞中Girdin蛋白表达量最高,用于后续研究。成功构建sh RNA表达载体Girdin-p GCH1/Neo和NC-p GCH1/Neo并经鉴定表明转染成功,Girdin si RNA细胞中Girdin蛋白的m RNA和蛋白含量均显著降低。2.MTT法结果表明Girdin si RNA细胞增殖活性显著低于Lo Vo细胞和NC细胞;流式细胞仪检测Lo Vo细胞、NC细胞和Girdin si RNA细胞周期分布和凋亡情况结果表明,Girdin si RNA组细胞在G0/G1期累积,S期和G2/M细胞百分数均降低,凋亡率为23.68%,是Lo Vo组的1.87倍;Western Blot方法检测细胞中凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2表达水平,结果显示,Girdin si RNA组cleaved caspase-3和Bax表达量显著高于Lo Vo细胞(P<0.01),分别是Lo Vo细胞的2.18倍和2.45倍;Girdin si RNA组Bcl-2表达量显著降低,为Lo Vo细胞的63%。说明,Girdin蛋白表达量下调可使肿瘤细胞周期停滞,分裂增殖活性降低,逆转肿瘤细胞抗凋亡,降低肿瘤生存率。3.细胞划痕实验结果显示Girdin si RNA细胞迁移距离显著低于Lo Vo细胞(P<0.05),表明其迁移能力显著下降;Transwell实验中Girdin si RNA组平均侵袭细胞数仅为37.00,显著低于Lo Vo组(85.40)和NC组(84.40)(P<0.001);Western Blot检测Girdin si RNA组细胞的迁移侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9、Vimentin表达量显著低于Lo Vo细胞(P<0.01),分别为Lo Vo细胞的41%,41%和51%。上述结果说明,Girdin蛋白表达量下调可降低肿瘤细胞中迁移侵袭相关蛋白表达量,有效抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭活动。4.Western Blot检测JAK/STAT信号通路蛋白结果表明,与Lo Vo和NC组相比,Girdin si RNA组细胞中p-JAK和p-STAT3相对表达量分别降低了37%和31%,IFN和IL-6的表达量分别降低了31%和45%;经JAK抑制剂LY2784544处理后NC细胞中JAK和STAT3的磷酸化降低,而Girdin si RNA细胞无显著变化,LY2784544处理的NC细胞和未处理的Girdin si RNA细胞之间p-JAK和p-STAT3蛋白表达水平无差异;Transwell实验结果表明经LY2784544处理后,NC细胞的侵袭性显著降低,与Girdin si RNA组细胞相似,而Girdin si RNA细胞经LY2784544处理后,细胞侵袭能力无明显变化。说明Girdin蛋白表达下调可降低JAK/STAT信号通路的激活水平,进而抑制经由该通路介导的增殖、侵袭等一系列细胞活性。5.体内实验显示,与Lo Vo组相比,Girdin si RNA组裸鼠肿瘤体积生长速度、各时间点平均肿瘤体积和肿瘤平均重量显著低于Lo Vo组;TUNEL检测结果显示Girdin si RNA组裸鼠肿瘤组织中凋亡细胞显著增多;Western Blot法检测肿瘤组织中侵袭相关蛋白表达下调。表明Girdin蛋白表达下调可有效抑制肿瘤细胞在体内环境的生长。结论:采用RNAi技术构建Girdin蛋白表达下调的Lo Vo细胞系;对细胞增殖活力、细胞周期、细胞凋亡情况、细胞凋亡蛋白表达水平检测表明Girdin蛋白表达下调可显著降低细胞增殖活性并促进细胞凋亡;细胞划痕实验、Transwell实验和对细胞侵袭相关蛋白检测表明Girdin蛋白表达下调可有效抑制细胞迁移侵袭;Girdin蛋白表达下调可降低JAK/STAT3信号通路激活从而抑制肿瘤细胞增殖、侵袭等活动;体内实验表明Girdin蛋白表达下调可显著抑制肿瘤细胞在体内环境下的增殖且诱导凋亡。综上Girdin蛋白在CRC肿瘤细胞恶性活动中具有重要作用,可作为CRC的临床治疗中潜在的新治疗靶点。