鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)是一种在全球范围内广泛存在的,可引起禽类慢性呼吸道病的一种病原微生物,属于支原体属。该病感染阳性率极高,在不继发感染的情况下死亡率较低,MG感染后,一般会引起饲料利用率降低,肉鸡的体重下降,以及造成雏鸡淘汰率上升,成年母鸡产蛋率下降等问题,给养禽业带来巨大的经济损失。临床上常见与其他疾病混合感染或由饲养管理不善、环境突变等因素引起的应激而导致MG的爆发,对禽类养殖业危害极大。由于支原体没有细胞壁结构,所以作用于细胞壁的抗生素对治疗本病无效,导致可选择的抗生素种类受限,加之抗生素的不合理使用,使得该病的药物研发尤为重要。中药组方治疗是根据MG的主要发病机制,以扶正祛邪为根本,达到标本兼治的目的,在临床实践中有很好的疗效,成为目前MG防治药物研发的热点方向。其中,黄芩苷是提取自中药黄芩根部的活性成分,国内外对该药物的研究十分重视。现代医学的大量研究表明黄芩苷具有明显的抗炎作用,能够有效抑制炎症反应的发生。对于黄芩苷作用机制的研究可以促进该药物的进一步发展及其在MG感染治疗方面的应用。本研究首先根据已有的MG感染模型的建立方法,利用被广泛认可的四种评价手段(SPA评分、格罗斯气囊病变评分、气管病变评分、气管黏膜厚度),对四种不同的感染方式(滴鼻点眼感染、气囊接种感染、混合感染、氢化可的松诱导感染)进行平行比较。结果显示以5×10~9CCU/mL的MG R株菌液用气囊接种的方法感染7日龄雏鸡,能够在感染后5 d观察到MG感染的典型临床症状,病程发展速度适中,适合用于本研究的后续治疗试验。在黄芩苷治疗试验中,用确立好的MG感染模型构建方法,根据其病程发展特点,于感染后第三天开始将黄芩苷混于水中饲喂治疗,剂量为1.5 g/只·d,持续7 d。分别于饮水饲喂治疗后1、4、7 d剖检采样,采用ELISA、透射电镜和Western Blot、Real Time-PCR等分子生物学技术,探讨黄芩苷对MG感染造成的炎症相关基因表达的影响以及在TLR2/NF-κB通路中p65蛋白扮演的角色。病理学和超微结构观察结果:通过病理学临床表现的格罗斯气囊病变评分、气管病变评分和SPA评分可见在经过黄芩苷混水饲喂治疗7 d后能够降低靶器官受到的组织损伤,病变程度明显减轻,且有统计学差异。利用透射电镜观察肺和气管细胞的超微结构时可以看到,MG感染组气管部位纤毛细胞固缩退化,脱落坏死。肺部组织中,肺泡Ⅰ型上皮细胞损伤严重,胞质破碎。黄芩苷治疗组主要表现为纤毛肿胀,顶端形成蘑菇状水肿泡,有纤毛相互融合的现象,肺泡Ⅰ型上皮细胞损伤明显减轻。由此可见黄芩苷治疗试验可以有效改善MG感染所带来的组织和细胞炎症损伤。炎症相关因子和p65蛋白的表达结果:感染后4 d,MG感染组与空白对照组相比经ELISA试剂盒检测炎性因子IL-1β、TNF-α表达量明显升高;Western Blot检测TLR2和P-p65蛋白含量同样显著升高(P<0.05)并于感染后7 d达到峰值,此时IL-1β、TNF-αmRNA的表达量也呈现出爆发性增长(P<0.01);感染后10 d,炎性因子和相关蛋白表达量有所下降。相比较于MG感染组,黄芩苷治疗组在给药1、4、7 d后,炎性因子IL-1β、TNF-α表达量显著下降(P<0.01)且相应蛋白TLR2和P-p65的表达量也明显低于MG感染组。综上,本试验在评价四种鸡毒支原体感染方式的基础上,用浓度为5×10~9 CCU/mL的MG R株菌液0.2 mL以气囊接种的方式感染7日龄雏鸡的模型进行黄芩苷抗MG感染作用及机理的研究。结果表明,黄芩苷能够通过抑制MG感染时炎性因子IL-1β、TNF-α的释放,干预MG感染造成的炎症损伤。同时,黄芩苷也能够通过抑制p65蛋白的磷酸化,干预TLR2-NFκB信号通路的活化,进而影响炎性因子的表达。