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随着预防性乙肝疫苗的推广普及,乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)的感染率已经明显下降,但全世界仍有2.4亿的慢性HBV感染(简称慢乙肝)者,每年有65万人死于HBV慢性感染相关的肝病,因此HBV慢性感染仍然是一个全球性的公共卫生问题。HBV感染肝细胞后,在肝细胞核内形成病毒的复制中间体“共价闭合环状DNA”(Covalently Closed Circular DNA,cccDNA),其含量低,半衰期长,是 HBV各种形式RNA转录的模板。目前认为,肝细胞内持续存在的cccDNA是乙肝病毒慢性感染和停药复发的主要原因。然而,现有的慢乙肝治疗药物核苷(酸)类似物(Nucleos(t)ide analogues,NAs)和干扰素 α(Interferon alpha,IFNα)虽然可以有效抑制HBV的复制,但前者对HBV cccDNA影响很小,且治疗周期长,存在耐药风险;后者可以一定程度上降低胞内cccDNA水平,但副作用大,适用人群有限。cccDNA药物的研发大大受限于药物筛选系统的缺乏,因此本研究试图建立一套稳定可靠的cccDNA药物筛选系统,并利用该系统探索cccDNA降解的潜在靶标。首先,我们采用改良的Hirt法提取HBV稳定整合细胞株HepAD38胞内的蛋白游离 DNA(Protein-free DNA,PF-DNA),对 cccDNA 进行鉴定,建立了cccDNA的Southern blot检测方法;并设计cccDNA特异的引物和探针,以HBV质粒作为标准品,建立了 cccDNA的qPCR检测体系,其线性范围为4.0×103-4.O×1O9copies/mL,R2=0.990。利用本实验室前期构建的过表达HBV感染受体牛磺胆酸钠协同转运多肽(sodium taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP)的细胞HepG2-NTCP 2B1进行HBV感染,并检测到胞内的cccDNA。利用慢乙肝治疗药物中的泰诺福韦(TDF)和干扰素α(IFNα2b)处理HBV感染后的HepG2-NTCP2B1细胞,并通过检测细胞分泌的HBV抗原和胞内外的病毒DNA,我们发现TDF和IFNα2b都可以有效抑制病毒的复制,但是TDF对病毒抗原和胞内cccDNA的抑制作用远不如IFNα2b。这与接受这两类药物治疗的慢乙肝患者体内病毒学指标的变化基本一致,说明该系统可以用于cccDNA药物的筛选。进一步分析HBV感染后的细胞胞内cccDNA与上清病毒抗原、胞内外HBVDNAs的相关性,我们发现上清HBeAg、胞内HBVDNAs与cccDNA的线性相关关系最明显(r=0.84,p<0.01;r=0.84,p<0.0001)。由于胞内 HBVDNAs 的检测涉及核酸提取,相对复杂,而上清HBeAg的定量检测快速简便,容易实现高通量操作,且HBeAg不受感染所带入的病毒的干扰,因此可以用上清HBeAg作为胞内HBV cccDNA的替代指标,在HepG2-NTCP2B1细胞模型的基础上建立一个稳定可靠的HBV cccDNA药物筛选系统。进一步研究发现细胞传代和冻存复苏会在一定程度上降低HBV感染后HepG2-NTCP2B1胞内外的病毒学指标,但不影响药物筛选的结果,这可以缩短药物筛选实验的周期。利用这个cccDNA药物筛选系统,我们试图寻找与HBV cccDNA降解相关的靶标。根据文献调研,我们将目标锁定在与HBV感染可能有关的四个宿主基因(Apobec3A、Apobec3B、ISG15 和 ISG20)上。利用不同浓度的 IFNα2b 刺激HBV感染和未感染的HepG2-NTCP 2B1,我们发现ISG15和ISG20的表达水平都有明显的上调,而且呈现明显的剂量依赖效应。在HepG2、Huh7、HepaRG和HepaRG-M14α细胞上,IFNα2b也可以特异地上调ISG15和ISG20的表达,但对Apobec3A和Apobec3B的表达几乎没有影响。我们构建了过表达Apobec3A、Apobec3B、ISG15和ISG20的慢病毒以及下调这些基因表达的RNAi腺病毒,在HBV感染的HepG2-NTCP2B1细胞上,分别过表达和下调这些基因,检测HBV抗原和cccDNA,最终确定干扰素特异性上调的ISG15和ISG20可以降解HBV cccDNA。综上,我们建立了一套稳定可靠的HBV cccDNA药物筛选系统,并利用该系统验证了慢乙肝治疗药物IFNα2b可以有效地抑制HBV感染的细胞胞内cccDNA水平。同时,也利用该系统发现并验证了两个被干扰素特异性上调、可以降解HBVcccDNA的宿主因子:ISG15和ISG20。