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目的:探讨ING4抑制肝细胞癌活性的机制。方法:1 ING4表达与临床病理特征的关系对78例人肝癌组织及其配对癌旁组织进行免疫组化染色。癌组织中ING4的表达与AJCC分期、肿瘤大小及微血管浸润进行统计分析。2构建ING4慢病毒转基因模型及敲减细胞模型我们选取ING4低表达MHCC97H细胞系,建立慢病毒介导的ING4过表达模型,同时选取ING4高表达的MHCC97L细胞系,用shRNA进行敲减。以荧光显微镜观察转染效率,Western blot验证转染后ING4表达变化。3 ING4转染及敲减细胞模型进行体内外表型及功能研究本研究对MHCC97H-ING4、MHCC97H-mock及MHCC97L-sh ING4、MHCC97L-shcontrol细胞进行了CCK8分析,绘制生存曲线。裸鼠BALB/c皮下种植细胞,观察肿瘤体内生长。对MHCC97H-ING4、MHCC97H-mock及MHCC97L-sh ING4、MHCC97L-shcontrol细胞进行Transwell小室实验及划痕实验,分析迁移侵袭能力。经BALB/c裸鼠尾静脉注射肿瘤细胞,观察其肺转移结节进行取样及HE染色并镜下计数。4 ING4调控FOXO3a的机制研究。qRT-PCR及Western blot分析,FOXO3a表达量及核内表达与ING4的关系。荧光素酶报告检测ING4对FOXO3a的转录活性的影响。Western blot检测FOXO3a下游靶基因:p27、Bim、Puma、FasL、TRAIL、Cyclin D1及β-catening的表达。我们对ING4过表达的MHCC97H-ING4肝细胞癌细胞进行了FOXO3a siRNA敲除,观察下游靶基因的变化。并观察肿瘤细胞功能的变化。观察四种细胞系中miR-155,miR-96、miR-182、miR-551b及miR-592表达变化。MHCC97H-ING4细胞模型中,进行MiR-155模拟或敲减分析,分析FOXO3a表达变化。首先通过Western blot分析了ING4对NF-κB p65的表达调控,并通过荧光素酶报告分析了对p65的转录影响。加入NF-κB的抑制剂,观察miR-155及FOXO3a的表达。对上述78例肝癌组织进行了ING4、NF-κB和FOXO3a免疫组化分析,并对miR-155进行了原位杂交分析。结果:1 ING4表达与临床病理特征的关系对78例人肝癌组织及其配对癌旁组织进行免疫组化染色结果表明:肝癌组织中ING4表达下降,在对照癌旁组织中可见ING4高表达。癌组织中ING4的表达与AJCC分期、肿瘤大小及微血管浸润呈负相关(p<0.05)。2成功构建ING4慢病毒转基因模型及敲减细胞模型我们选取ING4低表达MHCC97H细胞系,建立慢病毒介导的ING4过表达模型,同时选取ING4高表达的MHCC97L细胞系,用shRNA进行敲减。以荧光显微镜观察转基因效率约90%。ING4基因表达或基因敲减后的细胞模型均进行了Western blot分析,结果符合预期。3 ING4转染及敲减细胞模型进行体内外表型及功能研究本研究对MHCC97H-ING4、MHCC97H-mock及MHCC97L-sh ING4、MHCC97L-shcontrol细胞进行了CCK8分析,表明ING4的上调表达可显著抑制肝癌细胞在体外增殖及细胞球生成。反之,敲减ING4后其增殖能力明显增强。裸鼠BALB/c皮下种植模型,也在体内证实了这一点。对上述四种细胞进行了Transwell小室实验及划痕实验,MHCC97H-ING4细胞的迁移及侵袭能力明显减弱;ING4敲减后,其迁移侵袭能力明显增强。经无胸腺BALB/c裸鼠尾静脉注射,MHCC97H-ING4细胞与对照组相比,其形成肺转移结节的数量明显下降;反之,ING4敲减后,其肺转移能力明显增强。4 ING4调控FOXO3a的机制研究。qRT-PCR及Western blot分析,FOXO3a总表达量及核内表达均与ING4一致。荧光素酶报告检测进一步表明,ING4可显著增强FOXO3a的转录活性。同时,MHCC97H细胞中诱导ING4过表达,可上调FOXO3a下游靶基因:p27,Bim,Puma,FasL和TRAIL的表达,并下调了下游转录抑制靶基因:Cyclin D1的表达。敲除FOXO3a后,显著减弱了ING4对p27,Cyclin D1,Bim,Puma,Fas L,TRAIL andβ-catening的调节作用。我们对ING4过表达的MHCC97H-ING4肝细胞癌细胞进行了FOXO3a siRNA敲除,显著减弱了ING4诱导的凋亡,及对增殖、迁徙及侵袭的抑制作用研究发现,MHCC97H细胞系中导入ING4后,可显著下调miR-155,而miR-96、miR-182、miR-551b及miR-592表达均无变化。MHCC97H-ING4细胞模型中,进行MiR-155模拟分析,结果表明miR-155的过表达可明显阻断ING4对FOXO3a的上调作用;miR-155沉默可明显减弱ING4阻断对FOXO3a的下调作用。首先通过Western blot分析了ING4对NF-κB p65的表达,并通过荧光素酶报告分析了对p65的转录影响。MHCC97L-shING4细胞中ING4受到抑制,本应使miR-155表达上调,而NF-κB的抑制剂则阻断了miR-155的上调;同时,NF-κB的抑制剂阻断了MHCC97L-sh ING4细胞中ING4对FOXO3a的下调作用。我们对上述78例肝癌组织进行了ING4、NF-κB和FOXO3a免疫组化分析,并对miR-155进行了原位杂交分析。ING4的表达与FOXO3a呈正相关,与NF-κB(p65)和miR-155呈负相关。结论:ING4低表达为预后不良因素,且ING4表达与FOXO3a的表达呈正相关。ING4通过NF-κB、miR-155途径调控FOXO3a的表达,抑制肝癌细胞。