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研究背景与目的足细胞即肾小球脏层上皮细胞,位于肾小球基底膜外侧,足突是足细胞的特殊结构,相邻足突特异分子相互交联形成裂孔膜结构,裂孔膜是肾小球滤过膜分子屏障的重要结构基础。Nephrin是第一个被发现定位于裂孔膜的足细胞特异分子,其编码基因Nphsl突变导致芬兰型先天性肾病综合征。近年研究发现nephrin是同时具有结构蛋白和信号蛋白功能的足细胞特异分子。在多种人类肾小球疾病和动物模型中存在nephrin表达和／或分布异常,同时伴有足细胞表型改变,如足突融合和足细胞凋亡。肾素-血管紧张素系统(RAS)活性增加是慢性肾脏病进展和足细胞损伤的重要原因之一。AngⅡ作为RAS的主要效应分子,能通过血流动力学和非血流动力学多种途径引起肾小球损伤。本课题组前期研究发现AngⅡ可诱导培养的大鼠足细胞凋亡,AngⅡ持续输注可诱导大鼠足突融合和足细胞凋亡,nephrin表达和分布异常,足细胞凋亡率与nephrin表达呈负相关。AngⅡ诱导的足细胞表型改变可能与nephrin表达异常密切相关。本研究用体外培养的小鼠足细胞(MPC)观察AngⅡ刺激对nephrin表达和分布以及足细胞F-acitn骨架分布和细胞凋亡的影响,评价转染nephirn表达型质粒对AngⅡ诱导足细胞表型改变的影响以及PI3K/AKT信号通路在这一过程中的作用,进一步探讨AngⅡ引起足细胞表型改变和肾小球硬化的分子机制。方法第一部分：细胞分组：(1)不同浓度AngⅡ(10-12M～10-6M)处理永生化小鼠足细胞(MPC)；(2)10-8M AngⅡ刺激不同时间(3h,6h,12h,18h,24h)；(3) Losartan(10-6M)提前预处理1h后与AngⅡ(10-8M)共孵育18h。用FITC-Annexin/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率,Hoechst-33342染色观察凋亡足细胞形态。FITC-phalloidin染色标记足细胞F-actin,用外周F-actin环评分系统(CFS)半定量分析足细胞骨架运动。Real-time PCR和免疫荧光法检测nephrin mRNA表达和分布。第二部分：用双酶切和测序方法鉴定小鼠nephrin全长表达质粒pcDNA3.1-mNPHSl,脂质体法转染小鼠足细胞,用pcDNA3.1空载作对照,G418筛选稳定转染细胞系。RT-PCR和Western-blotting法鉴定稳定转染细胞系nephrinmRNA和蛋白表达。第三部分：(1)AngⅡ刺激MPC不同时间(5min,15min,30min,60min),MPC、空载体转染细胞和pcDNA3.1-mNPHS1转染细胞用AngⅡ刺激15min后,Western-blotting法检测磷酸化Akt和总Akt水平；(2)用AngⅡ和Akt抑制剂LY2940027(50μM)分别或共孵育刺激MPC 12h,用AngⅡ刺激MPC、空载体转染细胞和pcDNA3.1-mNPHS1转染细胞18h后,流式细胞仪检测凋亡率；(3)用LY2940027(50μM)刺激MPC 6h,AngⅡ刺激pcDNA3.1-mNPHS1转染细胞18h后,FITC-phalloidin染色分析F-actin分布。结果第一部分：AngⅡ以剂量和时间依赖方式诱导MPC凋亡。足细胞受AngⅡ刺激后足突回缩,由线状伪足转变为片状伪足。正常足细胞F-actin排列形成应力纤维,AngⅡ刺激后F-actin重组,应力纤维减少,F-actin沿胞体外周分布,形成F-actin外周环。AngⅡ刺激6h后CFS逐渐增加,差异有统计学意义(P<0.05)。Losartan与AngⅡ共孵育18h,显著降低AngⅡ单独刺激足细胞凋亡率(分别11.7%士2.6%比23.7%+3.4%，P<0.05),抑制F-actin重排,降低CFS(P<0.05)。AngⅡ刺激12h后nephrin mRNA较对照组显著降低,24h nephrin mRNA约为正常对照的50%(P<0.05)。正常足细胞nephrin主要分布于核膜周围的胞浆和细胞膜,随刺激时间延长,胞膜和胞浆nephrin表达逐渐降低。第二部分：Nephrin全长ORF经HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点连接于pcDNA3.1载体,pcDNA3.1-mNPHS1质粒稳定转染细胞株nephrin mRNA和蛋白表达水平约为未转染细胞的2倍(P<0.01)。第三部分：AngⅡ刺激15min后磷酸化Akt显著持续降低,约为正常细胞的50%(P<0.01)。AngⅡ与LY294002共孵育12h细胞凋亡率显著高于AngⅡ和LY2940027单独刺激(25.9%±2.7%比12.4%±2.1%和14.0%4±1.2%,P<0.05)。LY2940027孵育6h后,CFS指数显著高于正常足细胞(P<0.05)。pcDNA3.1-mNPHS1稳定转染显著上调足细胞磷酸化Akt水平(P<0.05),抑制AngⅡ诱导的细胞凋亡(AngⅡ刺激18h后pcDNA3.1-mNPHS1转染细胞和未转染细胞凋亡率分别7.8%±1.8%和18.6%±1.3%,P<0.05)。pcDNA3.1-mNPHS1转染促进足细胞短线状足突形成,AngⅡ刺激后pcDNA3.1-mNPHS1转染细胞仍伸出短线伪足,CFS指数高于未转染足细胞(P<0.05)。结论AngⅡ通过AT1受体诱导小鼠足细胞凋亡和肌动蛋白骨架重组,抑制足细胞表达nephrin, nephrin通过PI3K/Akt信号通路调节足细胞存活状态和肌动蛋白骨架组装,AngⅡ部分通过PI3K/Akt信号通路影响足细胞肌动蛋白骨架重排。本研究表明,AngⅡ诱导足细胞表型改变,nephrin通过PI3K/Akt信号稳定足细胞表型,进一步揭示了肾小球硬化进展的分子机制。