金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种在自然界中广泛分布的重要致病菌,在人类细菌性感染所导致的疾病中,其发病率仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌严重感染可导致中毒性休克、败血症、脑膜炎等,其中脑膜炎病死率超过50%,严重影响人类健康。上世纪60年代开始,由于抗生素滥用,直接导致了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的普遍存在,特别是近年来社区相关性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（CA-MRSA）的出现,使得金黄色葡萄球菌感染的临床治疗变得愈发困难。通常情况下,细菌性脑膜炎是病原与宿主复杂相互作用的结果。主要过程包括细菌定植、侵袭血管间隙、在血中存活、穿透血脑屏障等过程,从而导致脑膜炎的产生。其中,穿透血脑屏障是引起脑膜炎的关键环节,关于金黄色葡萄球菌穿血脑屏障的机制少有报道,目前仍不清楚。2007年,金黄色葡萄球菌酚溶调控蛋白（PSM）首次被发现,并被证明是CA-MRSA的关键毒力因子。其中,PSMα是PSM家族中致病力最强,也是研究的最多的一类毒素,包括由同一操纵子编码的四种结构类似、长约22个氨基酸的两亲性多肽,分别被命名为PSMα1、PSMα2、PSMα3、PSMα4。人们利用人工合成的PSMα进行相关研究发现其具有形成生物膜、裂解细胞、刺激炎症反应等多种功能。目前已有研究表明,PSMα可导致血管内皮细胞通透性的增加,这提示我们PSMα可能与金黄色葡萄球菌脑膜炎的形成有关。在本研究中,我们通过一系列动物实验和细胞实验,初步对金黄色葡萄球菌穿血脑屏障的具体方式以及PSMα在该过程中发挥的功能进行了探讨,并对影响PSMα4功能的关键氨基酸位点进行了研究。第一部分研究结果表明,PSMα可直接破坏血脑屏障的完整性,并能刺激与血脑屏障通透性相关炎症因子的产生。我们选取了CA-MRSA的典型代表USA300株,利用USA300株和PSMα敲除株进行了相关实验。由于后续实验需要对菌液中的菌数进行定量,同时为比较金黄色葡萄球菌PSMα基因敲除是否会影响其生长速度,我们首先对两株菌的生长曲线进行了测定。生长曲线结果显示,PSMα基因敲除后不会影响金黄色葡萄球菌的生长速率。然后,我们通过小鼠存活实验表明PSMα基因敲除后,金黄色葡萄球菌感染小鼠的存活率也大大提高,确认了PSMα是我们实验所用金黄色葡萄球菌USA300株的重要毒力因子。随后,我们通过尾静脉注射感染Balb/C小鼠,对小鼠血液和脑组织中的菌载量进行计数来判断USA300株和PSMα敲除株穿透小鼠血脑屏障的能力。在此实验之前,我们先对小鼠进行心脏灌注以避免脑组织毛细管中残留的血液影响实验结果。通过对灌注小鼠和非灌注小鼠脑组织菌载量进行计数,发现二者区别不大。为实验操作方便,后续小鼠脑组织菌载量计数过程中我们统一未进行灌注。体内实验结果表明,感染USA300株和PSMα敲除株后在小鼠血液中菌量较为稳定,且两株菌之间无显著差异,但小鼠脑组织中菌数有上升趋势,且第在48h、72h时,USA300感染组小鼠脑组织中的菌载量明显多于PSMα敲除株感染组小鼠。同时,我们对两株菌感染72h的小鼠脑组织分别进行病理切片观察,发现USA300株感染组小鼠脑组织损伤情况比PSMα敲除株感染组小鼠更为明显。为更直观的观察小鼠脑组织的整体损伤情况,我们对感染后的小鼠尾静脉注射Evans Blue,灌注后观察小鼠脑组织着色情况并用三氯乙酸萃取脑组织中的Evans Blue进行定量。结果显示,在感染72h时,USA300感染组小鼠脑组织中的Evans Blue含量明显多于PSMα敲除株感染组小鼠。以上动物实验结果表明:PSMα在金黄色葡萄球菌穿小鼠血脑屏障的过程中发挥着重要作用。接下来,我们利用血脑屏障体外模型,根据菌的穿透率来评价金黄色葡萄球菌穿透hCMEC/D3单层细胞的能力。我们在每个Milicell小室中加入5×10⁴个hCMEC/D3细胞,通过检测跨细胞电阻,发现培养约5天后,细胞会形成完整的单细胞层。此时,我们在每个Milicell小室中加入1.0×10⁷CFU对数生长期的金黄色葡萄球菌,作用一段时间后对下室培养基中的菌量进行计数,发现下室培养基中菌浓度仅约10²CFU/ml。此外,我们还用金黄色葡萄球菌进行了粘附和侵袭实验,结果表明,USA300株和PSMα敲除株的粘附率和侵袭率均较低,且两株菌之间无明显差别。这提示我们金黄色葡萄球菌不太可能通过直接穿细胞的方式穿透hCMEC/D3单细胞层。然后,我们将USA300株和PSMα敲除株的上清分别添加到血脑屏障体外模型中,并利用荧光黄作为指示剂,通过检测下室细胞培养基中的荧光强度和测定跨细胞膜电阻两种方法来显示hCMEC/D3单细胞层通透性的大小。结果显示,USA300株和PSMα敲除株的上清均能导致hCMEC/D3单细胞层通透性增加,并且USA300株上清造成的细胞通透性程度明显高于PSMα敲除株上清。同时,我们将USA300株和PSMα敲除株的上清分别与hCMEC/D3细胞相互作用,通过LDH试剂盒检测其细胞毒作用。LDH检测结果表明,两株菌的上清均可导致hCMEC/D3细胞裂解,但USA300上清的细胞毒作用更加显著。上述实验结果表明:金黄色葡萄球菌分泌的上清可破坏微血管内皮细胞的完整性,PSMα在这一过程中发挥着重要作用。根据上述结果以及我们在实验过程中发现金黄色葡萄球菌上清会导致hCMEC/D3细胞形态学的改变,所以我们利用western bolt检测了USA300株上清和PSMα敲除株上清分别与hCMEC/D3相互作用后与细胞紧密连接有关的claudin-5蛋白的表达情况。结果表明,两株菌上清与细胞相互作用1h时,与阴性对照相比细胞内cluadin-5表达量均为未出现明显变化。延长作用时间cluadin-5表达情况以及与细胞紧密连接相关的其它蛋白如occludin、JAM等的表达情况仍需检测。有研究结果显示,PSMα可引起炎症反应并刺激相关细胞因子的分泌。我们将生长对数期的USA300株和PSMα敲除株通过尾静脉注射到小鼠体内,一段时间后检测小鼠血清中脑膜炎相关炎症因子的分泌。根据检测结果,小鼠在感染金黄色葡萄球菌后,其体内的TNF-α、IL-8、IFN-γ、MIP-1α表达量与对照组相比均有明显升高,且在6h时感染USA300的小鼠TNF-α、IFN-γ表达量显著高于感染PSMα敲除株小鼠,感染24h起,感染USA300的小鼠体内IL-8表达量明显高于感染PSMα敲除株小鼠。此外,与脑膜炎相关的其它炎症因子如IL-1、IL-6等仍需检测。在第二部分研究中,我们利用丙氨酸突变探究PSMα4结构与功能的关系。首先,利用人工合成将多肽PSMα4中的非丙氨酸残基进行丙氨酸扫描定点突变。然后,用PSMα4及其突变体与人红细胞相互作用,通过检测OD₅₄₀（nm）值发现,仅第17位的氨基酸位点突变后,PSMα4才表现出了明显的溶血活性。于此同时,我们还用LDH试剂盒检测了PSMα4及其突变体对hCMEC/D3和人工分离的PMN的裂解程度,结果显示,PSMα4的第3,4,15,17位氨基酸突变后对细胞的裂解能力明显增强。随后我们选取了上述位点发生改变的突变体,利用圆二色性（CD）检测以比较其结构上的改变,发现PSMα4对细胞的裂解能力与其螺旋程度正相关。最后,我们在PDB网站上下载了结构已得到解析的PSMα1的分子模型,利用同源模拟初步预测了PSMα4的三维立体结构。综上所述,我们初步证明金黄色葡萄球菌穿血脑屏障与其能破坏脑微血管内皮细胞的完整性和刺激产生的炎症因子有关,且PSMα在这一过程中发挥着重要作用,对后续金黄色葡萄球菌脑膜炎的研究具有重要意义。并鉴定到了与PSMα4细胞毒和趋化作用密切相关的位点,为我们进一步了解PSM家族提供了一定的帮助。