传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的急性接触性传染病，是危害世界养禽业的主要传染病之一。IBDV主要侵害雏鸡的中枢免疫器官—法氏囊，导致免疫抑制。用弱毒苗和灭活苗免疫鸡群是目前防治IBD的主要方法，但随着IBDV变异株与超强毒株的出现，免疫失败常有发生。本文对IBDV基因免疫进行研究，期望为IBD的防治提供新的途径。 从浙江省杭州、嵊州，宁波等地暴发疑似传染性法氏囊病的鸡群中采集法氏囊病料(编号分别为ZJ2000、ZJ991、ZJ992)，分离病毒，经琼脂免疫扩散试验、动物回归试验、鸡胚回归试验和电镜观察等证实所分离的3株野毒是传染性法氏囊病病毒。 分别以传染性法氏囊病病毒ZJ2000株(野毒株)和JD1株(弱毒株)基因组dsRNA为模板，采用Long-accurate RT-PCR(LA-PCR)一步法扩增并克隆了两株病毒的基因组A节段全长cDNA。序列测定结果表明，两株病毒的基因组A节段全长共3259个核苷酸，包括5’、3’端的非编码区(NCR)和两个部分重叠的开放阅读框(ORF1和ORF2)。两株病毒的5’-NCR和3’-NCR与所有参比毒株一样高度保守，二级结构预测表明存在一个倒置“π”型的茎环发夹结构；ORF2编码145个氨基酸的VP5，与其他毒株的同源性达98.6％-100％，与K310、Cu-1、P2、CEF94等毒株完全相同；ORF1编码1012个氨基酸的多聚蛋白(VP2／VP4／VP3)，与Cu-1、P2、CEF94等毒株高度同源，并具有253H、279N、284T、330G等弱毒株或能直接细胞适应的强毒株的特征性氨基酸。JD1株在决定其抗原性的大小两个亲水区内高度保守，而ZJ2000株第二个小亲水区内280位氨基酸由S替代了N、290位L替代了M，这两个突变可能与ZJ2000株的抗原漂移和毒力变异有关。虽然JD1株和ZJ2000株序列高度同源，VP2内七肽区完全相同，但毒力表型完全不同，提示VP2七肽区并非是决定毒力的唯一因素。VP4蛋白酶活性位点附近540R的突变以及VP2-VP4剪切位点511R的突变，可能影响了多聚蛋白前体的剪切和加工使ZJ2000株的毒力增强。分子系统进化树分析表明，ZJ2000株和JD1株与Cu-1、P2、CEF94、Harbin等毒株的关系最近，而与欧洲、香港、日本的超强毒株和美国的变异株相对较远。 将IBDV-ZJ2000株和JD1株的多聚蛋白(VP2／VP4／VP3)基因和主要宿主保护性抗原(VP2)基因分别克隆入两种不同的真核表达载体pCI和pcDNA3，构建成两个毒株的 浙江大学博士学位论文：传染性祛氏囊病病毒基因免疫的b）f3t 摘要 ZJ2000株的pCIN 经纯化后，Lipofectin介导下转染Vero细胞，分别提取细胞 总DNA和总pA，DIG标记探针均可检测到阳性杂交信号。FITC标记的羊抗鸡IgG进行 间接免疫荧光试验可检测到特异性的黄绿色荧光。ELISA检测多聚蛋白的表达动力学表明转 染后72h表达的蛋白活性最强。结果表明pCIVPZ／VP4／VP3不仅重组到Vero细胞中，而且 得到了转录表达，表达的蛋白具有兔疫反应性。 以免疫刺激复合物（ISCOM）为佐剂分别制备ZJ2000和们 株的PCI－VPZ／VP4／VP3、 pCDNA3－VPZ／VP4／VP3、pCI－VPZ、pCDNA3－VPZ等8种DNA疫苗，接种14日龄非免疫来 杭鸡，28日龄二兔，二免后14天，攻击标准强毒株BC6／85，进行免疫原性筛选。结果表明： 编码多聚蛋白的表达载体能诱导较高水平的中和抗体并能提供对强毒的免疫保护；编码VPZ 基因的DNA疫苗仅能诱导很低水平的中和抗体，几乎不能提供免疫保护；以pCI为表达载 体的免疫效果优于 pCDNA3：源于 ZJ2000株基因构建成的 DNA疫苗诱导的免疫反应优于 JD 株。肌肉、皮内、肌肉皮内联合、静脉、腹腔、口服和点眼等7种途径均能不同程度诱导免 疫效果，其中以肌肉皮内联合免疫法效果最好，肌肉、皮内免疫次之，而口服、点眼途径最 差。低剂量的＊＊A疫苗＊50阴）不能产生足够的免疫力，20o叱的剂量为＊＊A疫苗的最 佳免疫剂量。以上结果说明IBDV多聚蛋白DNA疫苗具有良好的免疫原性，其最佳免疫方 案是：使用ZJ2000株的pCI－VPZ／VP4／VP3质粒，以ISCOM为佐剂制备DNA疫苗，最佳的 免疫剂量为 200pg／鸡，最佳的免疫途径为肌肉和皮下联合免疫法。 比较了DNA疫苗和两种常用的弱毒苗（B87、D78）的安全性和免疫效力。结果表明 DNA疫苗对雏鸡安全可靠，但弱毒苗对雏鸡有一定的毒力。虽然DNA疫苗产生中和抗体的 潜伏期相对较长、效价相对较低，但对强毒株BC6／85的攻击保护率与两种常用的弱毒苗 （B87、D78）相当，可能的原因是DNA疫苗同时诱导了鸡体的体液免疫和细胞免疫功能， 而且ISCOM增强了DNA疫苗免疫效果。DNA疫苗对BC6／85、ZJ2000、ZJ991等3株强毒 株具有良好的免疫保护效果，平均保护率达83．33％；弱毒苗B87虽对BC6／85株具有良好的 保护，但对ZJ991株、ZJ2000株的攻击不理想，平均保护率仅达60％。上述结果说明IBDV DNA疫苗不仅安全可靠，并且对不同强毒株具有良好的交叉保护效果。