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日本三角涡虫(Dugesia japonica)隶属扁形动物门(Platyhelminthes),涡虫纲(Turbellaria),在动物系统演化中占有重要地位,并且具有极强的损伤修复及再生能力。但到目前为止,其再生机制并不清楚。本实验利用生物信息学、原位杂交、RNAi以及qPCR技术,分析了DjSoxB1、DjSoxB2和DjSoxB3推导的蛋白结构、表达模式和功能,结果如下:利用生物信息学分析了DjSoxB1、DjSoxB2和DjSoxB3推导的氨基酸的结构和进化地位,结果显示:DjSoxB1、DjSoxB2和DjSoxB3属于SOXB亚家族且是不稳定的亲水性蛋白。DjSoxB1、DjSoxB2和DjSoxB3不仅含有SOX家族高度保守的HMG-box区域和标志性基序RPMNAFMVW,而且在HMG-box区域后面还包括8个SoxB亚家族的特征性序列标签。其中,DjSoxB2的特征基序与高等脊椎动物同源性较高且包含了一部分SoxP结构域。整体原位杂交及再生过程中qPCR结果显示:DjSoxB1、DjSoxB2和DjSoxB3基因在整体涡虫身体两侧的实质组织和再生片段的再生芽基处有较强杂交信号,特别是在再生的3-5d杂交信号较强,而这个时期是涡虫CNS形成和功能恢复的时期,DjSoxB1、DjSoxB2和DjSoxB3基因干扰后神经标记基因DjPC2表达水平显著下调,说明DjSoxB1、DjSoxB2和DjSoxB3参与了涡虫神经中枢的形成。DjSoxB1和DjSoxB2基因干扰后,整体涡虫没有明显的表型变化,但是再生涡虫的再生芽基在5-7d明显短于对照组,说明涡虫再生速度明显变慢。干扰组的尾再生头片段在再生第5d没有眼点形成。同时qPCR检测结果表明:DjSoxB1和DjSoxB2干扰后,干细胞标记基因DjPiwiA、细胞周期调节基因DjcyclinA/B、Djcdk、干细胞(neoblasts)早期分裂后代标记基因DjNB21.11.e表达水平显著调低,眼点标记基因Djovo在DjSoxB1干扰后期表达水平显著升高,而眼点标记基因Djtyrosinase在DjSoxB2干扰后期表达水平显著升高,说明DjSoxB1和DjSoxB2基因参与干细胞的增殖和组织的分化。尾再生头片段再生过程中出颈部向内凹陷的小头,头再生尾片段再生过程中出现歪尾现象,说明再生部分与原来身体的比例失调。qPCR检测结果表明:DjSoxB1干扰后背腹轴标记基因DjnlgA在干扰前期表达水平显著下调,而DjSoxB2干扰后DjnlgA和前后轴标记基因Djβ-catenin-1在干扰前期表达水平都显著下调,说明DjSoxB1和DjSoxB2在再生过程中参与了身体极性的构建。同时,DjSoxB1和DjSoxB2干扰后凋亡标志基因Djcaspase3在干扰后期表达水平显著上调,说明DjSoxB1和DjSoxB2基因可能与涡虫体内细胞凋亡相关。DjSoxB3基因干扰后,整体涡虫出现头部耳突处畸形,尾部溶解断裂和明显的运动障碍现象。再生涡虫在再生3d时没有长出明显的再生芽基,在再生的5-9d芽基明显短于对照组,说明再生速度受到了抑制。干扰组的尾再生头片段在再生第5d甚至少部分个体在再生的第7d没有形成眼点。qPCR检测结果表明:DjPiwiA、Djpcna、DjcyclinA、DjcyclinB、Djcdk、DjNB21.11.e、晚期分裂后代标记基因DjAGAT-2、zeta-NBs亚群标记基因Djzfp、sigma-NBs亚群标记基因DjSoxp1、细胞迁移标记基因Djmmp的表达水平均显著下调以及眼点标记基因Djtyrosinase表达水平显著调高,说明DjSoxB3在干细胞的增殖和组织的分化起着重要作用。同时,和DjSoxB1和DjSoxB2一样,DjSoxB3基因干扰后出现了小头畸形和歪尾现象,说明再生部分与原来身体的比例失调。q PCR检测结果也表明DjSoxB3干扰后DjnlgA、Djβ-catenin-1和尾部标记基因DjFrizzled表达水平都显著下调,说明DjSoxB3在再生过程中参与了身体极性的构建。另外,DjSoxB3干扰后,肌肉标记基因Djmhcb、纤毛标记基因DjIFT和DjLC1表达水平显著下调;运动速度测量结果表明DjSoxB3干扰组涡虫的运动速度明显慢于对照组,说明DjSoxB3参与运动系统的维持。DjSoxB3干扰后凋亡标志基因Djcaspase3表达水平显著上调,提示DjSoxB3参与细胞的凋亡。qPCR检测结果也表明DjSoxB3干扰后DjPC2的标记基因表达水平显著下调,表明DjSoxB3参与神经中枢的形成。另外DjSoxB3干扰组对涡虫表型影响更大,同时,DjSoxB3干扰后期,DjSoxB1和DjSoxB2的表达量下调到了极显著水平,所以认为在DjSoxB家族中DjSoxB3对涡虫组织的维持及再生起着更为重要的作用,是DjSoxB家族中关键调节基因。DjSoxB1与DjSoxB2共干扰结果表明,除了出现DjSoxB1和DjSoxB2单独干扰的表型外,整体涡虫出现头部溶解,耳突处畸形;另外qPCR检测结果表明DjSoxB1不影响DjSoxB2的表达,DjSoxB2只在干扰后期影响DjSoxB1的表达,说明共干扰后整体涡虫出现头部溶解,耳突畸形的现象是由于DjSoxB1与DjSoxB2两个基因功能叠加造成的。DjSoxB2与DjSoxB3共干扰结果表明:除了出现DjSoxB2和DjSoxB3单独干扰的表型外,整体涡虫出现多眼点现象,尾再生头片段出现眼点比例不协调现象;qPCR检测结果表明DjSoxB2与DjSoxB3之间互相影响,说明DjSoxB2与DjSoxB3共干扰结果也是由DjSoxB2与DjSoxB3之间的协同作用造成的。综上所述,DjSoxB1、DjSoxB2和DjSoxB3基因在日本三角涡虫中广泛表达,DjSoxBs基因间在功能上相互交叉,相互协同。在再生过程中参与了干细胞增殖、组织分化及极性的构建,特别是在再生早期起重要作用。