[背景]乳腺癌(breast cancer, BC),是当今世界上女性最常见的恶性肿瘤之一。肿瘤是一种高度异质性的疾病,其在不同的患者同一阶段具有不同的生物学行为,这已成为肿瘤界的共识。通过近年来长期对乳腺癌的分子生物学机制的研究,基于不同肿瘤分子分型的个体化治疗已经成为乳腺癌治疗的主要方向。个性化医疗的前提是正确理解预后和预测参数,这仍然是目前乳腺癌治疗方面非常重要且热门的研究领域。随着分子生物医学的发展,科学家们探讨了众多乳腺癌相关分子的预后作用,临床实践中最常用的指标包括人类表皮生长因子受体(human epidermal growth factor receptor-2, HER2),雌激素受体(estrogen receptor, ER),孕激素受体(progesterone receptor, PR)和Ki67。其中,Ki67,一种上世纪80年代初发现的抗原,已被报道与乳腺癌的预后密切相关。Ki67是一种核内抗原,最初在上世纪80年代初由Gerdes等证实。Gerdes通过对霍奇金淋巴瘤细胞系核抗原进行免疫获得了小鼠Ki67的单克隆抗体。由于当时的实验地点是在德国Kiel大学,该克隆的获得位置是96孔板的第67位,因此命名为Ki67。Ki67在细胞周期的不同时期表达不尽相同。在细胞周期的G1,S,G2,和有丝分裂的M期均有Ki67的表达,其中在G1和S期表达水平较低,但在有丝分裂期表达水平达到峰值,随着有丝分裂进入后期(后期和末期),Ki67水平急剧下降,而在GO期无表达。Ki67作为使用最广泛的增殖标记物,近年来由于其在预后方面的预测作用吸引了越来越多的目光。许多研究表明,Ki67的表达水平与乳腺癌预后呈负相关。然而,到目前为止,由于Ki67高表达指数的临界值定义不一致,而且检测技术也不尽相同,导致各研究结果的基线不完全一致,很难做出准确又客观的判断。界定的不同必将导致Ki67指数的不同,因此对预后的预测差异较大,大大限制了其在临床上的应用。虽然近年来Ki67自动计数软件逐渐发展起来,为临床检测带来巨大方便,但是到目前为止还没有证据表明它比人工计数更好,更准确。此外,最终通过传统的计算机软件获得的结果是Ki67表达的总数,而不是Ki67表达百分比(受肿瘤细胞总数的影响)。因此,迫切需要发展一种更为准确和客观评价乳腺癌中Ki67表达的方法。量子点(quantum dots, QDs)是具有独特尺寸和表面效应的荧光纳米颗粒。由于其优良的性能被广泛应用于生物成像,定位和检测。量子点的明显优势包括：荧光强度高,抗光漂白,化学降解强,尺寸可调的发射波长和在单光源激发光下同时发射多种荧光光谱。在本研究中,我们旨在建立一个基于量子点的Ki67、细胞角蛋白(cytokeratin, CK,本研究中一种用于标记肿瘤细胞的上皮特异性标记物)定量和原位多光谱成像,以便更好地评估其对乳腺癌预后的影响。为了更准确、客观地评价Ki67的表达,Ki67/CK值将被用来代替Ki67百分比。[目的]本研究的目的是运用量子点多光谱成像技术开发基于荧光光谱的Ki67和细胞角蛋白的定量及原位、实时、同时成像,评估其对乳腺癌预后的影响。[方法]我们的肿瘤中心建立了一个全面的乳腺癌数据库。在本研究中我们通过5年随访收集了240例乳腺癌样本(480个芯片,每个芯片直径1.5毫米).每位患者都建立了详尽的临床病理资料,包括年龄,绝经状态,T分期,N分期,组织学分级,ER和HER2基因表达水平等。基于我们系统建立的数据库,ER和HER2水平的检测是由临床实验室的病理专家遵循最新的病理学指导完成的：通过免疫组化(IHC)检测ER水平,荧光原位杂交(fluorescent in-situ hybridization, FISH)检测HER2水平。我们建立了一种基于量子点的原位多光谱荧光成像方法,Ki67免疫染色使用Ki67单克隆兔抗,使用生物素化标记的抗兔IgG和链霉亲和素偶联的QDs-605可以使细胞核发出Ki67的红色荧光。用抗小鼠的CK单克隆抗体进行CK免疫组化染色,羊抗小鼠IgG与QDs-525用于在细胞质中发出CK的绿色荧光,每个芯片通过同时拍摄6张图像获取Ki67和CK量子点荧光信息。为了验证上述成像技术以及比较乳腺癌中不同成像方法的技术特点,我们对三种成像方法进行了直接比较,即常规苏木精-伊红(HE)染色,Ki67和CK分别免疫组化染色,基于量子点的CK和Ki67同时多光谱成像。采集图像后,Ki67和CK的分离和定量借助于CRi Nuance多光谱成像系统。我们获得了每一位患者的Ki67和CK值,以及Ki67/CK值。下一步X-tile软件将会发挥作用,主要通过结果来评估生物标记物并寻求最佳截点,自动判断Ki67总值和Ki67/CK值的截点,并将其分为两类,设定为Ⅰ级和Ⅱ级。我们使用SPSS 17.0软件对收集到的实验结果进行统计分析,利用皮尔森卡方检定对类别变量进行相关性的检验。用Kaplan-Meier生存曲线和log-rank检验分析五年无病生存期(five-year disease free survival,5-DFS)与各因素的关系。通过Cox多因素风险比例模型进行多因素分析。采用受试者工作特征曲线(ROC)分析法计算独立预后因子的预测值。[结果]我们首先比较了乳腺癌不同成像方法的技术特点。HE染色可以显示肿瘤的组织结构,肿瘤细胞侵入基质形成癌巢,但图像难以区分肿瘤与基质,不能明确显示肿瘤巢的侵袭边缘。免疫组化染色只能标记清楚Ki67,但不能清楚显示癌巢,因此很难在技术上精确量化癌巢Ki67百分比。同样,对CK进行免疫组化染色可以标记清楚癌巢,但不能标记Ki67。相比之下,量子点对CK和Ki67的多分子成像可以同时标记Ki67和癌巢,可以根据CK和Ki67清晰区分癌巢及基质。基于量子点同时对核中的Ki67和细胞质中CK染色可形成鲜明的信号对比,便于信号的分离和定量。基于最佳P值原理的X-tile软件采用5-DFS进行预测,自动设定Ki67总值和Ki67/CK值的截点分别为3.58×107和0.186。基于以上截点,Ki67和Ki67/CK各分为两级。我们随后观察了乳腺癌中Ki67的表达模式。Ki67表达水平的高低与增殖无关,而Ki67阳性表达率与增殖活性呈正相关。Ki67主要表达于癌细胞的细胞核,很少表达于基质,从不表达于血管。Ki67在浸润导管癌癌巢中表达水平较高而在原位癌的癌巢中表达相对较低。对于原位癌,Ki67显著表达于癌巢周围,癌巢中心相对较少。对于浸润性癌Ki67的表达较无序,我们在在杂乱无章的癌巢中可观察到Ki67的表达。Ki67在微创原位癌以及浸润性导管癌的癌巢侵袭边缘具有较高的表达水平。当一个大的瘤巢产生较小的种植瘤巢,两癌巢间的连接处Ki67表达较高。Ki67的等级在总体患者以及淋巴结阳性患者中与5-DFS呈负相关,但在淋巴结阴性组与5-DFS无相关性。Ki67/CK等级在总体患者,淋巴结阴性组,淋巴结阳性组与5-DFS均呈负相关。然后将已通过Kaplan-Meier生存分析验证过的Ki67等级或Ki67/CK等级和传统的预后指标进行COX比例风险模型分析。Ki67/CK分级的危险比(HR)(HR 2.019,95% CI[1.254-3.251])高于N分期(HR 1.819,95% CI[1.501-2.204])和HER2基因(HR 1.748,95% CI [1.087-2.812]),但低于组织学分级(HR 3.370,95 CI为[1.125-5.364]).此外,Ki67/CK分级的重要性和风险比(HR)(P=0.004;HR 2.019,95% CI[1.254-3.251])高于Ki67分级(P=0.047;HR 1.773,95% CI[1.009-3.117]).此外,ROC分析Ki67/CK分级曲线下面积(AUC)(AUC:0.683,95% CI:0.613-0.752)高于Ki67分级(AUC:0.665,95% CI:0.596-0.734)和HER-2基因(AUC:0.586,95% CI:0.510-0.661),但低于N分期(AUC:0.760,95% CI:0.696-0.823)和组织学分级(AUC:0.756,95% CI:0.692-0.820).[结论]本研究基于量子点的多分子成像技术探讨了Ki67和CK在乳腺癌组织中的表达,证实了Ki67/CK分级是一个预测乳腺癌预后优于Ki67分级的预后因素。