柯萨奇病毒(coxsackievirus, CV)是一种肠道病毒(enterovirus, EV),分为A和B两类血清型,B组有6型病毒。柯萨奇病毒B组可引起呼吸道感染、腹泻、脑膜炎、心肌炎、新生儿严重感染等,尤其是病毒性心肌炎(viral myocarditis, VMC)最常见的原因。病毒性心肌炎也可由其他肠道病毒引起。目前对病毒性心肌炎的临床诊断,主要依靠临床症状及常规生化检查和心电图,但是由于病毒性心肌炎发病初期的症状不典型,往往出现临床症状时已经累及心肌,引起心肌不可逆的损伤,造成严重后果。虽然血清学方法已广泛应用于诊断病毒感染,但无法明确诊断感染病毒的种类。本研究通过对柯萨奇病毒B1,B2,B3及其他肠道病毒保守区基因序列进行分析,分别设计高度特异性的引物与Taqman探针,建立了四重荧光定量rRT-PCR,采用一步法可同时检测Cox1、CoxB2、CoxB3以及其他肠道病毒。本研究分二部分：第一部分为四重荧光定量rRT-PCR法检测柯萨奇病毒B1、B2、B3及其他肠道病毒方法的建立；第二部分为四重荧光定量rRT-PCR法的临床应用。第一部分四重荧光定量rRT-PCR法检测柯萨奇病毒B1、B2、B3及其他肠道病毒方法的建立1.方法：(1)从美国的NCBI基因库下载了涵盖国内外CoxB1、CoxB2、CoxB3以及肠道病毒的多条基因序列。利用DNAMAN软件对其进行了同源性比较,确定以上病毒基因组的保守区。使用Primer Express3.0软件在其保守区设计高度特异性的引物与Taqman探针,引物和探针序列均通过Blast验证。(2)优化反应体系,利用CoxB1、CoxB2、CoxB3核酸片段和轮状病毒、诺如病毒、札如病毒、腺病毒、EV71、CoxA16等分离株评价该法的特异性,对已标定拷贝数的标准品(相应质粒)进行稀释,平行进行荧光定量RT-PCR反应,比较其灵敏度。(3)此外,对每一个浓度的阳性核酸稀释液作6次重复检测,得到的CT值计算其标准差和变异系数,验证该方法的重复性。2.结果：(1)敏感性和特异性本方法检测CoxB1、CoxB2、CoxB3和其他肠道病毒灵敏度均达到103copies/ml.对CoxB1、CoxB2、CoxB3和肠道病毒具有较好的特异性,CoxB1、CoxB2、CoxB3引物探针与其他病毒如轮状病毒、诺如病毒、札如病毒、腺病毒、EV71、CoxA16等均无交叉反应。(2)重复性对每一个浓度的样本作6个重复检测,结果不同核酸浓度各自的检测CT值标准差在0.09～0.28之间,变异系数均低于1.0%,具有较好的重复性。3.结论：所建立的四重荧光定量rRT-PCR法可同时检测并区分CoxB1、CoxB2、CoxB3和其他未分型的肠道病毒,其检测快速、准确,具有非常大的临床推广应用价值。第二部分四重荧光定量rRT-PCR法检测柯萨奇病毒B1、B2、B3及其他肠道病毒方法的临床应用1.方法：利用所建立的四重荧光定量rRT-PCR方法对所采集到的病毒性心肌炎疑似患儿535份粪便标本和43份咽拭子标本进行检测,对结果进行统计分析。并随机选取10份阳性标本进行基因测序,进一步验证本方法的准确性。2.结果：578份标本共检测到肠道病毒153份,阳性率为26.5%(153/578),其中CoxB1病毒69份,阳性率为11.9%(69/578)；CoxB2病毒18份,阳性率为3.1%(18/578)；CoxB3病毒27份,阳性率为4.7%(27/578)；其他类型肠道病毒39份,阳性率为6.7%(39/578)。随机选取CoxBl、CoxB2、CoxB3各10份阳性标本进一步测序结果均与该方法的检测结果一致。3.结论：本法建立的实时荧光定量PCR技术简便快捷、重复性好、可以实时定量,可对临床上疑似肠道病毒感染的患儿,特别是小儿病毒性心肌炎患儿提供早期明确诊断,并且可区分病毒感染的种类及滴度,为临床治疗方案的制定提供参考依据。