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第一部分 Fascin-1促进下咽鳞癌侵袭和转移的机制研究实验目的:Fascin-1是一种肌动蛋白成束蛋白,主要与F-actin结合并连接成有序、平行的微丝束,参与细胞粘附和细胞迁移的调控,在多种肿瘤呈高表达,并与肿瘤的侵袭转移密切相关。然而fascin-1在下咽鳞癌组织中的表达情况以及fascin-1在下咽癌侵袭和转移中的内在分子机制尚不明确。因此,本实验主要研究以下二个方面的内容:1、探讨fascin-1在下咽鳞癌组织的表达及其与临床病理资料和预后的关系;2、探讨fascin-1表达变化对下咽癌FaDu细胞形态、迁移和侵袭能力的影响以及fascin-1促进下咽癌侵袭和转移的内在分子机制。实验方法:1、以96例下咽鳞癌组织标本为研究对象,采用免疫组织化学法,检测fascin-1蛋白在下咽鳞癌癌组织和癌旁组织的表达情况,并进一步分析其表达与下咽鳞癌临床病理资料(年龄,性别、肿瘤大小、临床分期、病理分级、颈淋巴结转移、肺转移)及预后的关系。2、以下咽癌FaDu细胞系为研究对象,分别应用fascin-1 siRNA和fascin-1过表达质粒转染下咽癌FaDu细胞,沉默或上调fascin-1表达,并设置对照组。(1)应用 Western blot 法,检测 fascin-1 siRNA 和 fascin-1 过表达质粒转染下咽癌FaDu细胞后fascin-1沉默或过表达FaDu细胞的转染效率;(2)应用鬼笔环肽染色荧光共聚焦显微镜显影,观察fascin-1沉默或过表达对下咽癌FaDu细胞形态的影响;(3)通过细胞划痕愈合试验和迁移试验,观察fascin-1沉默或过表达对下咽癌FaDu细胞迁移能力的影响;通过侵袭实验,观察fascin-1沉默或过表达对下咽癌FaDu细胞侵袭能力的影响;(4)应用Western blot法检测fascin-1沉默或过表达对E-cadherin、vimentin等EMT发生相关蛋白及MMP-2、MMP-9等侵袭转移相关蛋白表达的影响。实验结果:1、Fascin-1在下咽癌癌组织的阳性表达率明显高于其在癌旁组织的表达,并且两者差异有统计学意义。2、Fascin-1表达与下咽鳞癌的肿瘤TNM分期、颈淋巴结转移明显相关;与患者的性别、年龄、病理分级、肿瘤T分级及术后肺转移无明显相关;Fascin-1表达与下咽鳞癌患者的3年生存率无明显相关。3、在细胞形态学上,与对照组相比,fascin-1沉默组细胞形态近圆形,伴有较少的细胞膜突出物和丝状伪足;与对照组相比,fascin-1过表达组细胞形态有明显极性,呈纺锤体形,伴有较多的细胞膜突出物和丝状伪足。4、在划痕-愈合试验中,与对照组相比,fascin-1沉默组中细胞向无细胞的划痕区域迁移的速度明显减慢;与对照组相比,fascin-1过表达组中细胞向无细胞的划痕区域迁移的速度明显增快。在迁移试验中,与对照组相比,fascin-1沉默组中迁移细胞数明显减少,差异有统计学意义;与对照组相比,fascin-1过表达组中迁移细胞数明显增加,差异有统计学意义。在侵袭试验中,与对照组相比,fascin-1沉默组中侵袭细胞数明显减少,差异有统计学意义;与对照组相比,fascin-1过表达组中侵袭细胞数明显增加,差异有统计学意义。5、应用Western blot检测发现,与对照组相比,fascin-1沉默组中MMP-2的表达明显降低,差异有统计学意义;与对照组相比,fascin-1过表达组中MMP-2的表达明显升高,差异有统计学意义;但fascin-1表达变化对MMP-9及与EMT发生相关蛋白E-cadherin、vimentin的表达无影响。实验结论:1、通过对下咽癌组织标本研究表明,fascin-1参与下咽鳞癌的发生、侵袭和转移过程并发挥重要作用;2、通过对fascin-1 siRNA和fascin-1过表达质粒转染后的下咽癌FaDu细胞研究表明,fascin-1可通过改变细胞形态,提高肿瘤细胞的迁移和侵袭能力,并通过增加肿瘤细胞中MMP-2的表达,进一步促进下咽癌的侵袭和转移。第二部分 缺氧通过HIF-1 α-fascin-1正反馈环路促进下咽鳞癌侵袭和转移的机制研究实验目的:缺氧在实体肿瘤微环境中普遍存在,并在肿瘤的侵袭和转移中发挥重要作用。HIF-1α是调控细胞对缺氧反应的重要因子,并参与多种与肿瘤侵袭转移相关的靶基因的调控。Fascin-1是一种球形肌动蛋白交联蛋白,并与肿瘤的侵袭和转移密切相关。文献报道,fascin与HIF-1α在胰腺癌中存在共表达并有明显相关性。因此,本实验主要研究以下几个方面的内容:1、探讨fascin-1与HIF-1α蛋白在下咽鳞癌组织连续切片的表达情况及其表达的相关性;2、应用CoCl2诱导缺氧建立化学缺氧模型,探讨缺氧对下咽癌FaDu细胞迁移和侵袭能力的影响以及缺氧促进下咽癌FaDu细胞侵袭和转移的内在分子机制;3、探讨缺氧对下咽癌FaDu细胞中HIF-1α和fascin-1表达的影响,以及HIF-1 α与fascin-1参与缺氧促进下咽癌FaDu细胞侵袭转移的内在调控机制;4、探讨在下咽癌FaDu细胞中HIF-1α与fascin-1之间的内在调控关系。实验方法:1、以下咽鳞癌组织标本为研究对象,采用免疫组织化学法,检测fascin-1在下咽鳞癌组织连续切片的表达情况及其表达的相关性。2、以下咽癌FaDu细胞为研究对象,首先应用CoCl2诱导化学缺氧,模拟缺氧环境,建立缺氧模型。(1)应用CoCl2诱导缺氧建立化学缺氧模型,通过Western blot法和CCK 8细胞毒性试验筛选合适的CoCl2浓度和CoCl2处理时间;(2)通过划痕-愈合试验、迁移和侵袭试验,研究CoCl2诱导的缺氧对下咽癌FaDu细胞迁移和侵袭能力的影响;通过Westernblot检测CoCl2诱导的缺氧促进下咽癌侵袭和转移的内在机制;(3)应用HIF-1α siRNA沉默HIF-1α表达,通过Westernblot验证缺氧是否通过HIF-1α促进下咽癌的侵袭和转移;应用fascin-1 siRNA沉默fascin-1表达,通过Westernblot验证缺氧是否通过fascin-1促进下咽癌的侵袭和转移;(4)通过HIF-1α沉默或过表达,应用Westernblot检测HIF-1α表达变化对fascin-1表达的影响;通过fascin-1沉默或过表达,应用Westernblot检测fascin-1表达变化对HIF-1α表达的影响。实验结果:1、对下咽鳞癌组织连续切片进行免疫组化染色发现,fascin-1与HIF-1α在下咽鳞癌中存在共表达,并且两者的表达有明显相关性。2、缺氧促进下咽癌FaDu细胞的侵袭和转移通过划痕-愈合试验研究发现,与常氧环境相比,在CoCl2诱导的缺氧环境中肿瘤细胞向无细胞的划痕区域迁移的速度明显加快;在迁移试验中也观察到类似的结果,与常氧环境相比,在CoCl2诱导的缺氧环境中迁移细胞数明显增多,且差异有统计学意义;在侵袭试验中,与常氧环境相比,在CoCl2诱导的缺氧环境中侵袭细胞数明显增多,且差异有统计学意义。通过Western blot检测发现,与常氧环境相比,在CoC12诱导的缺氧环境下,伴随着HIF-1α表达的升高,下咽癌FaDu细胞中MMP-2表达明显升高。3、缺氧上调下咽癌FaDu细胞中HIF-1α和fascin-1的表达通过Western blot检测发现,与常氧环境相比,在CoC12诱导的缺氧环境下,伴随着HIF-1α表达的升高,下咽癌FaDu细胞中fascin-1表达也明显升高。4、缺氧通过HIF-1α促进下咽癌FaDu细胞的侵袭和转移通过划痕-愈合试验研究发现,HIF-1 α沉默可抑制在缺氧环境下细胞向无细胞的划痕区域迁移的速度;在迁移试验中也观察到类似的结果,HIF-1α沉默可减少缺氧环境下的迁移细胞数,且差异有统计学意义;通过侵袭试验研究发现,HIF-1α沉默可减少缺氧环境下的侵袭细胞数,且差异有统计学意义。通过Western blot检测发现,在CoCl2诱导的缺氧环境下,HIF-1α沉默可降低下咽癌FaDu细胞中MMP-2的表达。5、缺氧通过fascin-1促进下咽癌FaDu细胞的侵袭和转移通过划痕-愈合试验研究发现,fascin-1沉默可抑制缺氧环境下细胞向无细胞的划痕区域迁移的速度;在迁移试验中也观察到类似的结果,fascin-1沉默可减少缺氧环境下的迁移细胞数,且差异有统计学意义;通过侵袭试验研究发现,fascin-1沉默可减少缺氧环境下的侵袭细胞数,且差异有统计学意义。通过Western blot检测发现,在CoCl2诱导的缺氧环境下,fascin-1沉默后可下调MMP-2的表达。6、在下咽癌FaDu细胞中,HIF-1 α和fascin-1存在相互调控关系通过Western blot检测发现,在缺氧环境下,HIF-1 α沉默可明显降低下咽癌FaDu细胞中fascin-1的表达;在常氧环境下,HIF-1 α过表达可明显上调下咽癌FaDu细胞中fascin-1的表达;同样,在常氧和缺氧环境下,fascin-1沉默可明显降低下咽癌FaDu细胞中HIF-1α的表达;在常氧环境下,fascin-1过表达可明显上调下咽癌FaDu细胞中HIF-1α的表达。实验结论:1、HIF-1α和fascin-1在下咽鳞癌组织中表达明显相关,HIF-1α可能参与fascin-1在下咽鳞癌组织中的高表达。2、缺氧可促进下咽癌FaDu细胞的迁移和侵袭;3、缺氧可上调下咽癌FaDu细胞中HIF-1α和fascin-1的表达并通过HIF-1α或fascin-1促进下咽癌FaDu细胞的迁移和侵袭;4、在下咽癌FaDu细胞侵袭转移中,HIF-1α和fascin-1之间存在相互的正向调控关系;5、缺氧通过HIF-1α-fascin-1正反馈环路促进下咽癌FaDu细胞的侵袭和转移,HIF-1α-fascin-1环路有可能成为下咽癌治疗的新靶点。