研究背景和目的呼吸运动是维持生命活动不可或缺的生理过程,主要在中枢神经系统（脑、脊髓）以及外周神经系统的协同调控下完成。呼吸运动的节律和模式起源于脑干呼吸中枢模式发生器（respiratory central pattern generator,r CPG）,同时也接受高位中枢如大脑皮层、外侧下丘脑等的调控。这些脑中的呼吸相关核团对呼吸运动的调节最终通过脊髓呼吸神经网络向吸气肌（膈肌和肋间肌）发出纤维投射,从而调控吸气运动不间断的发生。在哺乳动物中,脊髓呼吸神经网络非常重要,其不仅接受上游呼吸中枢的传入信号,且传出兴奋调节吸气泵肌始动吸气,是呼吸运动的关键枢纽。在平静状态下,脊髓呼吸运动神经元激动膈肌和肋间肌协同收缩,产生跨膈压和胸膜腔压力差,以实现肺部通气。而这些神经元功能障碍会导致明显呼吸困难、呼吸衰竭甚至死亡。但目前对应支配吸气泵肌（膈肌和肋间肌）的脊髓呼吸运动神经元的形态学分布特征并不十分清楚。同时脊髓中还存在大量神经元向非呼吸肌发出纤维投射,且这些神经纤维可能与调节呼吸的神经来自相同的脊髓节段,但具体意义不明;这些都极大的限制了临床疾病如睡眠呼吸暂停综合征、肌萎缩侧索硬化症、脊髓损伤等呼吸困难症状的治疗。因此,研究脊髓呼吸运动神经元的形态学分布特征,是了解脊髓呼吸神经网络调控的必要前提,也是进一步研究上游呼吸中枢神经网络,以及中枢性呼吸障碍相关疾病的病理生理机制十分重要的基础。近年来,示踪技术极大的促进了神经科学解剖领域研究进展。常用的逆行示踪剂包括霍乱毒素β亚基（cholera toxinβ-subunit,CTB）和伪狂犬病毒（pseudorabies virus,PRV）两种。其中CTB从轴突末梢感染吸收,并沿轴突逆行示踪神经元胞体。PRV是目前最常用的外周到中枢逆行嗜神经病毒,能在神经元之间严格逆行跨突触传递,其逆向跨突触的级数取决于其在动物体内的感染时间,并且通过在PRV基础上加入荧光蛋白原件,可以实现病毒感染标记的神经元可视化。为了解脊髓呼吸膈运动神经元和肋间运动神经元的形态学分布特征,本课题拟采用外周到中枢的逆行示踪技术,分别对成年小鼠膈肌和肋间肌进行微量注射分析这些神经元的分布情况,并对这些脊髓呼吸运动神经元与对应脊髓节段的非呼吸相关运动神经元的空间位置进行比较;探讨呼吸膈运动神经元和肋间运动神经元的全脊髓分布模式规律,以期为呼吸中枢神经系统的进一步研究奠定解剖学基础。材料与方法本研究包括以下几个方面:1.CTB和PRV介导膈运动神经元逆行示踪比较:对成年C57BL/6小鼠,选用CTB555（n=3）和PRV-EGFP（n=4）示踪剂分别微量注射至膈肌进行示踪,并比较两者的感染效率。2.脊髓膈运动神经元的形态学分布特征:注射CTB555至膈肌（n=3）后,取小鼠全脊髓组织进行纵向和冠状切片,使用共聚焦显微成像技术对阳性标记的切片进行拍照采集和结果分析。3.膈运动神经元和三角肌运动神经元分布特征的比较:在同侧膈肌和三角肌分别注射CTB555和CTB488（n=3）,10天后取脊髓组织,对有荧光标记的切片进一步进行免疫荧光染色鉴定神经元类型,并比较这些神经元的空间分布特征。4.CTB和PRV介导肋间运动神经元逆行示踪比较:对成年C57BL/6小鼠,应用CTB555（n=3）和PRV-EGFP（n=3）两种不同的示踪剂分别对右侧第3肋间肌进行示踪,并比较标记结果。5.支配所有肋间肌的肋间运动神经元的分布特征:应用CTB555对同侧1-12肋间肌（每个肋间肌n=3）逐一进行示踪并进一步分析示踪结果。6.肋间运动神经元和腹斜肌运动神经元空间分布的比较:成年小鼠同侧腹斜肌和对应肋间肌分别注射CTB555和CTB488（n=3）来示踪标记对应的运动神经元,共聚焦显微成像技术分析这些运动神经元的形态学特征。结果1.CTB和PRV介导膈运动神经元逆行示踪比较右侧膈肌CTB555注射10天后,在脊髓C3-C6节段前角标记到膈运动神经元。PRV-EGFP注射2-2.5天后也在相同的位置发现标记的神经元。对比PRV-EGFP和CTB555标记的阳性节段距离和节段阳性神经元比例差异均无统计学意义（CTB555:n=3PRV-EGFP:n=4,P＞0.05,非配对t-test）。2.脊髓膈运动神经元的形态学分布特征CTB555注射进膈肌感染10天后,取脊髓组织纵向切片,发现所有膈运动神经元分布在同侧脊髓灰质,不存在交叉现象;冠状切片发现神经元分布在C3-C6节段phrenic motoneurons of lamina 9（Ph9）区域,标记的节段头-尾端距离为1.44±0.12 mm,共标记到76.00±1.73个膈运动神经元,其中以C4节段的分布最为集中。3.膈运动神经元和三角肌运动神经元分布特征的比较颈髓C5-C6节段同侧前角发现标记的三角肌运动神经元和膈运动神经元。这些神经元的大小差异没有统计学意义（膈运动神经元:n=31,三角肌运动神经元:n=14,P＞0.05,非配对t-test）。三角肌运动神经元位于deltoid motoneurons of lamina 9（De9）区域,而膈运动神经元分布在前角更腹内侧的Ph9区域。通过免疫荧光染色技术发现这些神经元均能和胆碱能神经元标记物Ch AT共标。4.CTB和PRV介导肋间动神经元逆行标记比较应用CTB555对右侧第3肋间肌注射后进行逆行示踪,发现标记的神经元分布在同侧T2、T3节段前角。右侧第3肋间肌PRV-EGFP感染后,在T2-T3节段的脊髓前角位置也发现被标记的神经元。进一步比较CTB555和PRV-EGFP标记神经元的阳性节段距离和节段神经元比例,差异均无统计学意义（n=3,P＞0.05,配对t-test）。5.支配所有肋间肌的肋间运动神经元的分布特征应用CTB555对同侧第1-12肋间肌进行示踪,发现CTB555标记的肋间运动神经元在胸髓T1-T11节段同侧前角的内侧和外侧区域,而主要分布在外侧的Intercostal muscle motoneurons of lamina 9（ICo9）位置,且这些神经元均为胆碱能神经元。每个肋间肌可接受来自相邻1-3脊髓节段的肋间运动神经元支配,并且同一个脊髓节段的肋间运动神经元可支配相邻的1-3个肋间,并非一一对应的。这些神经元在T1-T11节段中存在头-尾端递减的分布趋势,且以T2脊髓节段最为密集。6.肋间运动神经元和腹斜肌运动神经元空间分布的比较利用CTB555对腹斜肌注射进行逆行示踪,发现其标记的胆碱能腹斜肌运动神经元分布在T6-T8节段,其中以T7节段的神经元数量最多。结合前述支配第8肋间肌的肋间运动神经元同样分布在T7节段,所以在同侧腹斜肌和第8肋间肌同时注射CTB555和CTB488,发现肋间肌运动神经元主要分布在更腹外侧的ICo9区域,而腹斜肌运动神经元则位于内侧的Lamina 8 of the spinal gray（8Sp）区域。7.膈运动神经元和肋间运动神经元分布模式的比较膈运动神经元分布在颈髓的C3-C6节段中从头端到尾端逐渐向前角内侧偏移,而肋间运动神经元在胸髓的T1-T11节段的纵柱中则比较均匀的分布在前角的外侧区域。C3-C6节段膈运动神经元密度相对均一,而T1-T11节段的肋间运动神经元密度以T2最为集中,存在头-尾端递减的趋势。膈运动神经元相对于非呼吸相关的三角肌运动神经元分布在前角腹内侧的区域,而肋间运动神经元相对于非呼吸相关的腹斜肌运动神经元分布在前角更腹外侧的区域。结论1.膈运动神经元分布在颈髓C3-C6节段前角Ph9区域;2.膈运动神经元与对应节段的非呼吸相关的三角肌运动神经元对比,其分布在前角更腹内侧的位置,而三角肌运动神经元分布在相对背外侧的De9区域;3.成年小鼠的呼吸肋间运动神经元分布在胸髓T1-T11节段前角外侧ICo9和内侧Ax9区域,但主要分布在前角外侧ICo9区域;4.肋间运动神经元与对应节段的非呼吸相关的腹斜肌运动神经元相比,分布在前角更腹外侧的位置,而腹斜肌运动神经元则分布在相对背内侧的8Sp区域;5.膈运动神经元在C3-C6节段神经元分布比较均一,而肋间运动神经元在T1-T11节段神经元数量变异较大。