研究背景：肾细胞癌(RCC)在泌尿系肿瘤中较为常见,其发病率占肾恶性肿瘤的80-90%,仅次于膀胱尿路上皮癌。晚期肾癌临床治疗较为棘手。近年来在临床发病率逐年上升,其主要来源于肾实质泌尿小管上皮系统。约有25%-30%肾细胞癌患者在早期诊断时即存在局部浸润或远处转移。肾癌如早期发现无转移或转移较少,其存活率较高。肾癌对放、化疗敏感度较低,对于早期治疗,外科局部切除为首选。但对于晚期转移肾癌而言,在进行减瘤肾切除后,仍需要进行全身治疗,如靶向治疗和免疫治疗。肾癌具有多耐药性,所以化疗对肾癌疗效很差。肾癌的多耐药可能由于存在高浓度的多耐药基因MDR-1产物p糖蛋白,可以主动将化疗药物泵出癌细胞。有研究表明化疗结合免疫治疗能够达到良好的效果。近年来出现的分子靶向治疗药物为晚期肾癌患者的治疗,带来了新的希望。随着近年来对基因表观遗传学即不改变遗传的碱基序列只改变其修饰的深入研究,学术界认为表观遗传学中DNA甲基化对于肿瘤的发生发展起到重要的作用,肿瘤的产生与DNA甲基化紊乱和失衡相关,与正常细胞相比较,肿瘤细胞出现大范围的低甲基化和CpGs岛高甲基化并存,其中后者是引起肿瘤恶化和转移的关键因素。去甲基化剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(DAC)可限制DNA甲基转移酶类,使DNA甲基化发生转换。因此DAC近年来被认为是对于多种恶性肿瘤均有很好疗效的药物(恶性骨髓瘤、肺癌、肝癌等),其疗效不但可以抑制原发灶浸润,更可以有效抑制肿瘤转移。而顺铂类化疗药物是细胞周期非特异性药物,主要抑制肿瘤细胞的DNA复制,抗癌范围广,但由于特异性差,所以单一用药疗效不佳,一般临床要联合用药,以提高其治疗效果。近年来有报道去甲基化化疗药物5-氮杂-2’-脱氧胞苷(DAC)联合顺铂类化疗药物可以提高后者的抑制肺癌的疗效,但其两者联合治疗的分子生物学机制及对其他癌细胞治疗效果尚不清楚。细胞的凋亡为细胞在基因调控下的程序性死亡,而肿瘤的的发生一般认为是细胞凋亡失衡,即促进细胞凋亡的基因减少,抑制凋亡的基因增量表达,凋亡酶激活因子1(APAF-1)是一种作用于半胱天冬酶活化过程的p53相关路径基因,在线粒体参与的凋亡途径中具有重要作用。通常认为诱导凋亡的基因p53通过诱导特异性细胞凋亡基因如APAF-1, Bax, PUMA, Noxa等的表达,来触发线粒体细胞凋亡途径。因此如果能从研究单纯DAC和单纯顺铂,及联合DAC和顺铂对肾细胞癌去甲基化的影响,及对细胞凋亡基因APAF-1表达的作用,就可以从体外细胞水平研究其两类抗癌药物的分子机制,并进一步发现两类药物对癌细胞凋亡的作用机制,并为其他药物治疗肾细胞癌提供新的抗癌靶点。本课题的研究思路是：通过体外从mRNA和蛋白水平研究去甲基化剂DAC对人类肾癌细胞系ACHN和Caki两类细胞去甲基化程度的影响,并比较去甲基化剂DAC与顺铂类(CDDP)单独或联合用药,不同药物浓度对人类肾癌细胞系ACHN和Caki两类细胞去甲基化的影响,为去甲基化剂DAC与CDDP联合用药治疗肾细胞癌提供分子机制基础。我们并进一步通过研究去甲基化剂DAC与CDDP单独或联合用药,不同药物浓度对人类肾癌细胞系ACHN和Caki两类细胞凋亡酶激活因子1(APAF-1)影响,并从通过抑制APAF-1的表达来降低半胱天冬酶9和半胱天冬酶3的活性,研究AC N细胞中去甲基化剂DAC与CDDP协同诱导的凋亡的过程,为探索肾癌细胞的抗凋亡途径及治疗提供指导,本次研究可应用于后续试验,对提高肾细胞癌的的治疗疗效,提高患者预后生存质量具有重要的意义。第一部分：5-氮杂-2’-脱氧胞苷和顺铂在肾癌细胞中去甲基化作用机制研究1.目的：研究去甲基化剂DAC对人类肾癌细胞系ACHN和Caki两类细胞去甲基化程度的影响,并比较去甲基化剂DAC与CDDP单独或联合用药,不同药物浓度对人类肾癌细胞系A CHN和Caki两类细胞去甲基化的影响,为去甲基化剂DAC与CDDP联合用药治疗肾细胞癌提供分子机制基础,并进一步验证去甲基化剂DAC与CDDP联合用药对肾癌细胞的剂量依赖性,为进一步动物和临床药理学实验提供参考。2.方法：用不同浓度的DAC与CDDP单独或联合培养人类肾癌细胞系ACHN和Caki。用甲基化特异性PCR法测定不同方法培养的肾癌细胞系ACHN和Caki甲基化水平。进行MTT细胞活性检测和细胞凋亡检测。对结果利用SPSS13.0软件进行统计学处理,实验结果用双尾t检验检验。3.结果：1).DAC与AC N和Caki细胞培养,降低了ACHN和Caki细胞DNA甲基化水平。2).DAC与CDDP的协同作用降低了肾癌细胞的活性。3).DAC与CDDP的浓度与肾癌细胞的活性相关联。第二部分：5-氮杂-2’-脱氧胞苷和顺铂在肾癌细胞中通过增强凋亡酶激活因子1的活性协同诱导细胞凋亡机制的研究1.目的 希望通过体外从mRNA和蛋白水平研究去甲基化剂DAC人类肾癌细胞系ACHN和Caki两类细胞APAF-1甲基化程度的影响,并比较去甲基化剂DAC与CDDP单独或联合用药,不同药物浓度对人类肾癌细胞系ACHN和Caki两类细胞对APAF-1的影响,为去甲基化剂DAC与CDDP联合用药治疗肾细胞癌提供分子机制基础。2.方法：1)用不同浓度的DAC与CDDP单独或联合用药培养人类肾癌细胞系ACHN和Caki,利用甲基化特异性PCR及实时反转录PCR测量甲基化CPG及APAF-1 mRNA的整体甲基化水平。2)用不同浓度的DAC与CDDP单独或联合用药培养人类肾癌细胞系ACHN和Caki,利用免疫蛋白印迹测量APAF-1蛋白水平。3)用不同浓度的DAC与CDDP单独或联合用药培养人类肾癌细胞系ACHN和Caki,检测两类细胞的活性,并比较其对两类细胞生长影响的差异。4)用不同浓度剂量的DAC与CDDP单独或联合用药培养人类肾癌细胞系ACHN和Caki,检测两类细胞的的凋亡率,并比较其对两类细凋亡影响的差异。5)用不同浓度的DAC与CDDP单独或联合用药与沉默APAF-1表达的人类肾癌细胞系ACHN进行培养,利用LEHDase分析和DEADase分析细胞中半胱天冬酶9和半胱天冬酶3的活性,并检测细胞凋亡,分析APAF-1在甲基化剂DCA与CDDP治疗肾细胞癌的作用机制。全部数据采用SPSS13.0软件进行统计学分析,多组间不同组别间差异比较采用方差分析,两组间比较采用双尾t检验,显著性水平设定为0.05,当P值小于0.05,差异具有统计学意义。结果(1)在Caki和ACHN细胞中,DAC处理降低了DNA甲基化水平,提高了APAF-1的表达水平.(2)在肾癌ACHN和Caki细胞中DAC和CDDP的协同作用诱导有效的细胞凋亡。(3)抑制APAF-1的表达阻滞了ACHN细胞中由DAC和CDDP协同诱导的细胞凋亡。结论(1)我们成功培养了人类肾癌细胞系ACHN和Caki,并沉默ACHN细胞中APAF-1表达(对APAF-1特异的siRNA转染ACHN细胞)。(2)在Caki和ACHN细胞中,DAC处理降低了DNA甲基化水平,提高了APAF-1的表达水平。(3)DAC和CDDP的协同作用降低了肾癌细胞的活性。(4)肾癌ACHN和Caki细胞中DAC和CDDP的协同作用诱导有效的细胞凋亡。(5)抑制APAF-1的表达阻滞了ACHN细胞中由DAC和CDDP协同诱导的细胞凋亡。