[目 的]原发性胆汁性胆管炎（Primary biliary cholangitis,PBC）是一种自身免疫性肝病,肝内小胆管特异性免疫损伤和血清中升高的抗线粒体抗体（Anti-mitochondrial antibodies,AMAs）是其临床特征,可由胆管炎进展为胆汁淤积性肝硬化。PBC的发病机制不清,熊去氧胆酸（Ursodeoxycholic acid,UDCA）及奥贝胆酸（Obeticholic acid,OCA）作为PBC一线治疗药物可有效缓解肝内胆汁淤积并延缓肝纤维化,但部分患者应答不佳且缺乏精准的病情监测靶标。因此,研究PBC致病机制、寻找有效诊治方案仍是目前研究的焦点。研究表明PBC患者脂肪酸（Fatty acids,FAs）谱变化明显,肝内门脉区炎症细胞大量集聚,我们推测二者之间存在一定联系。此外,肠道微生物及代谢物可影响机体免疫系统的调控及体内FAs的变化,由肠道微生物-代谢物-肝脏三者构成的致病因素可能介入到PBC的致病中。本研究从临床样本、致病细胞、动物模型入手,检测了 PBC血清FAs、肠道微生物群、肠道代谢物和肝内免疫炎症,为进一步研究微生物-代谢物-肝脏三者在PBC病理发展中的作用提供依据。[方 法]第一部分1.纳入昆明医科大学第二附属医院消化内科初次确诊的PBC患者49名,同期选取46名健康人群作为对照（Healthy controls,HCs）,收集受试者外周血、肝组织蜡块（仅PBC组）及临床信息。研究开展前已获得昆明医科大学第二附属医院医学伦理委员会审批,受试者完全知情且签署知情同意书后进行采样。2.ELISA检测PBC患者外周血细胞因子IL-17、IL-6、IL-23和TNF-α水平。3.利用质谱仪检测PBC及HCs组血清游离FAs,比较两组脂肪酸谱的变化,分析差异FAs与肝功能、肝组织病理学进展和血清炎症因子的相关性。4.根据差异脂肪酸(ω-6 FAs的高低水平挑选PBC样本并分为high ω-6 FAs组（n=6）和low ω-6 FAs组（n=3）,同时匹配5名HCs,利用转录组测序技术分析比较3组外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）转录信息,筛选与ω-6 FAs变化密切相关的基因。5.GEO数据库下载GSE79850芯片数据,该数据芯片包括了 24 位人的肝组织 RNA 组学信息（HCs 8 人,Low-risk PBC 7 人,High-risk PBC 9人）,利用生物信息学分析技术对肝脏转录情况进行对比分析,挑选与疾病进展相关的基因。6.结合PBC患者外周转录本与肝脏转录本的情况,筛选出与ω-6 FAs、肝内炎症进展相关的信号通路。7.利用流式细胞术、ELISA、免疫荧光法及qRT-PCR在全部样本中验证筛选出的信号通路表达情况。第二部分1.体外培养人胆管上皮细胞（Biliary epithelial cells,BECs）,使用甘氨鹅脱氧胆酸（Glycochenodeoxycholic acid,GCDC）诱导BECs凋亡,流式细胞术检测凋亡情况。2.使用不同浓度的亚油酸（Linoleic acid,LA;18:2 n-6）处理BECs凋亡体系,流式细胞术评估BECs凋亡水平。3.使用不同浓度的LA处理BECs凋亡体系,免疫荧光法评估BECs免疫表位暴露的情况。4.使用不同浓度的LA处理BECs凋亡体系,ELISA检测BECs分泌CCL5的水平。5.使用流式细胞术对PBC患者外周血CCR5+细胞分群,筛选差异细胞亚型。6.使用不同浓度的LA处理PBC患者CD4+T细胞,同时选择或不选择对CD4+T细胞进行CCR5 blocking,再予 CD4+T 细胞 CCL5 刺激,ELISA 检测 CD4+T 细胞分泌 IL-17A、IL-2、TNF-α BAFF及IFN-γ的水平。7.Transwell实验检测不同浓度LA处理下CD4+CCR5+T细胞趋化能力。8.使用2-辛炔酸结合牛血清白蛋白（2-Octynoic acid-bovine serum albumin,2-OA-BSA）及聚肌胞苷酸（Polycytidylic acid,PolyI:C）的方案建立PBC小鼠模型,根据处理措施分为空白对照组、PBC组、ω-6 FA组（PBC造模基础上予LA灌胃）及ω-6 FA+Maraviroc组（PBC造模基础上予LA灌胃及CCR5及拮抗剂Maraviroc处理）。9.质谱技术检测小鼠血清及肝脏ω-6 FAs水平。10.免疫荧光法检测小鼠肝内CCL5、CCR5、CD45表达情况。11.免疫组化法检测小鼠肝内Ly6G、F4/80、CD11b、CD4、CD8和CD19表达情况。12.流式细胞术检测小鼠肝内CTL、Th17和Treg比例。13.HE染色评估小鼠肝内门脉区炎症,Masson染色评估肝内胶原沉积情况。14.ELISA检测小鼠血清IL-17、TNF-α水平。15.检测小鼠血清梗阻酶。第三部分1.于昆明医科大学第二附属医院消化内科收集12名PBC患者及12名正常人粪便;2.利用16S rDNA测序技术对粪便进行微生物多样性检测,注释菌群种属后进行比较分析和功能预测;3.利用质谱技术对粪便进行肠道代谢物检测,与正常人对比分析,预测差异代谢物功能;4.联合分析PBC差异菌群及代谢物,计算二者共现率,分析二者共参与的功能通路信息。[结 果]第一部分1.PBC患者血清游离脂肪酸水平较HCs明显变化,ω-6 FAs明显升高（P＜0.01）,且升高的ω-6 FAs与血清γ-谷氨酰转移酶（γ-glutamyltransferase,GGT）、IL-17A成正相关,晚期组织学患者ω-6/ω-3 FAs 比率升高（P＜0.05）。2.Highω-6 PBC组PBMC中特有差异基因1193个,C-C基序趋化因子配体5（C-C motif chemokine ligand 5,CCL5）显著低表达;High risk PBC组肝脏特有差异基因178个,C-C基序趋化因子受体5（C-C motifchemokine receptor 5,CCR5）显著上调。3.ELISA检测显示PBC患者血清游离CCL5升高（P＜0.001）,qRT-PCR技术显示PBC患者PBMC的CCL5水平降低（P＜0.0001）。4.流式细胞术检测PBC外周血CCR5+细胞比明显增高（P＜0.0001）,肝脏免疫荧光染色显示进展期PBC患者肝内门脉区CCR5+细胞浸润增强,CCL5高表达于进展患者肝内胆管上皮细胞中。第二部分1.800μM/12h的GCDC可以成功诱导BECs凋亡。2.LA可以促进BECs凋亡,随LA浓度的增加,BECs的凋亡比例增高。3.BECs凋亡后暴露免疫表位PDC-E2,LA增加BECs凋亡后PDC-E2的暴露。4.凋亡的BECs分泌CCL5增多,使用LA可促进BECs分泌CCL5。5.high ω-6 FAs PBC患者外周血CD4+CCR5+T细胞明显增高,使用LA处理CD4+T细胞后,CD4+T细胞面对CCL5刺激可分泌较高水平的IL-17A、TNF-α BAFF及IFN-γ,CCR5 blocking可以抑制这一效果。6.使用LA处理CD4+T细胞后,CD4+CCR5+T细胞趋化作用增强,CCR5 blocking可以抑制这一效果。7.LA喂养可以提高小鼠体内ω-6 FAs水平,肝内CCL5/CCR5信号轴增强。8.ω-6 FA小鼠较PBC组小鼠肝内门脉区三级淋巴结构（tertiary lymphoid structures,TLSs）明显增多、天然免疫细胞（Ly6G+中心粒细胞、F4/80+巨噬细胞、CD11b+天然免疫细胞）及适应性免疫细胞（CD4+T、CD8+T和CD19+B细胞）门脉区浸润增强、CTL和Th17比例上调、Treg比例下降、肝功能及炎症因子上升、胆管损伤加重并有纤维化发生,ω-6 FA+Maraviroc组小鼠上述反应明显降低。第三部分1.PBC患者肠道微生物多样性下降,益生菌降低,条件致病菌增多。2.PBC患者肠道代谢物较常人变化明显,脂质分子下降显著。3.差异肠道菌群及差异肠道代谢物存在功能相似的变化,可协同影响机体病原体感染、ω-6 FAs代谢和胆汁分泌等方面的功能。[结 论]1.PBC患者血清FAs谱异常,ω-6 FAs升高且与PBC病理进展相关。2.CCL5/CCR5轴是PBC炎症调控、病理进展的关键,或可成为抑制PBC炎症的新靶点。3.ω-6 FAs可以在体外促进胆管上皮细胞凋亡、免疫表位PDC-E2暴露增多、CCL5分泌增加。4.ω-6 FAs可以在体外激活CCL5/CCR5信号轴促进CD4+CCR5+T细胞发挥趋化效应并分泌炎症因子。5.ω-6 FAs可以在PBC小鼠体内增强肝内CCL5/CCR5信号轴,诱发门脉区TLSs炎性发展、血清炎症因子升高、肝内胆管炎症加重和胶原沉积。6.PBC肠道菌群及肠道代谢物较常人明显改变,菌群多样性降低、组内差异度增大,益生菌降低,条件致病菌增多。7.PBC肠道代谢物较常人变化显著,脂质分子下降为突出特点。8.PBC差异微生物和差异代谢物在功能上有相关性和协同作用,可形成促病原体侵犯、炎症介质上调和胆汁分泌障碍的肠道环境,促进疾病发生发展。9.由肠道微生物-代谢物-肝脏三者构成的肠-肝“对话网”是PBC发生发展中重要的调控线,对三者关系深层的理解将有助于我们回答这种疾病带来的疑惑并减轻疾病负担。