研究背景膀胱尿路上皮由基底细胞层、中间细胞层和伞细胞层组成,是血液和尿液之间的重要屏障。维持正常的膀胱尿路上皮功能对膀胱内环境稳态的平衡至关重要,许多膀胱疾病的病理生理、治疗策略与膀胱尿路上皮生物学特性和功能息息有关。研究膀胱尿路上皮细胞类型、特异性的细胞标记物以及信号受体等将有助于我们进一步了解膀胱尿路上皮细胞与膀胱疾病之间的关系。鉴于膀胱结构复杂,细胞成分多样,传统方法在研究膀胱尿路上皮细胞的细胞特征和功能方面具有很大的局限性,且不能精准的获得膀胱尿路上皮细胞的异质性和层次分布结构。近年兴起的单细胞RNA测序技术为解决上述问题提供有效途径,极大的方便了我们对正常生理活动下膀胱和疾病过程中的特定细胞功能进行分类与研究。目前单细胞RNA测序技术已经被广泛应用,但针对膀胱尿路上皮细胞的高通量单细胞RNA测序目前未见报道。研究目的本研究旨在借助单细胞RNA测序,对小鼠膀胱尿路上皮细胞进行更为精确的分类,并对其功能进行深入探究并进一步明确其在膀胱疾病中发挥的特定作用。研究方法1.单细胞测序选取10周龄C57BL/6J小鼠取得膀胱上皮细胞。采用单细胞3’ Reagent v3试剂盒制备单细胞RNA测序文库。使用Cell Ranger软件生成每个细胞及其基因的的表达矩阵并去除低质量的细胞和重复捕获的多细胞。采用主成分分析（PCA）对可变基因进行降维处理后聚类,最终将所有细胞分为不同细胞亚群。2.数据分析使用Monocle2进行拟时序分析;使用velocyto进行RNA速度分析;使用SCENIC构建基因调控网络（GRNs）进行调控子分析;使用CellChat进行细胞间通信分析。3.细胞鉴定与功能验证通过免疫荧光鉴定Plxna4+和ASPM+细胞在膀胱上皮的表达情况;通过细胞学实验验证细胞功能。研究结果1.小鼠膀胱尿路上皮细胞的单细胞分析及无监督聚类研究从小鼠膀胱尿路上皮中获得单细胞悬液。使用台盼蓝染色和Calcein-AM/PI染色保证活细胞百分比均在90%以上。通过严格的质量控制,将获得的18917个膀胱尿路上皮细胞纳入下一步分析。2.基于细胞特异性标记基因的尿路上皮细胞分类通过无监督聚类分析确定了 8个不同的细胞亚群,对所有细胞进行差异基因表达分析来进一步研究每个亚群的特异性。根据已知的细胞类型标记基因的特异性表达,Cluster 0、Cluster 5和Cluster 6被归为基底细胞,分别被命名为基底细胞1、2、3（Bc 1、Bc 2和Bc 3）。Cluster 1和Cluster 2被定义为中间细胞1（Ic 1）和中间细胞2（Ic 2）。Cluster 3和Cluster 4被定义为伞细胞1和伞细胞2（Sc 1和Sc 2）。Cluster 7未富集任何已知的膀胱上皮细胞特异性标记物,根据其特异性基因Plxna4命名为Plxna4+尿路上皮细胞。3.发育轨迹和RNA速度分析揭示了小鼠膀胱尿路上皮细胞的发育谱系利用反向图嵌入生成拟时序轨迹图,并利用拟时序分析进行细胞轨迹分析。Bc 3是细胞轨迹的起点,随后是Bc 1和Bc 2。Ic 2,Sc 1和Sc 2细胞位于轨迹分支1的末端。Plxna4+尿路上皮细胞位于轨迹支2的末端。进一步将影响细胞发育轨迹的基因富集为基因簇1、2两个基因簇。基因簇1包括Malat1、Ftl1、Tpt1,S100a6和Ly6d是发育轨迹后期高表达的基因;基因簇2包括Gstm1和Tmsb4x,是发育轨迹早期高表达的基因。通过分析RNA速度来研究尿路上皮细胞的发育谱系。结果表明,Ic 1和Ic 2细胞参与了Sc 1和Sc 2的转化。Sc 1和Sc 2没有明显的转换关系。4.膀胱尿路上皮细胞中调控子的表达模式CSI的基础上比较每个调控子的活性评分,聚类活性相近的调控子,最终获得4个主要模块。模块2（M2）包含12个调控子被证实在细胞分化中发挥重要作用。这些调控子的活性在基底细胞亚群中较高,而在伞细胞中较低;在Bc 1和Ic 1中,Foxa1、Foxq1和Ikzf2的调控特异性评分较高;在基因表达水平上,其对应基因表达水平在Sc 2中最高。5.尿路上皮细胞间信号交流通过Cellchat分析膀胱上皮细胞亚群信号强度。Bc 3传出信号强度最强,而Bc 1、Bc 3和Sc 2具有较强的传入信号强度。随后对尿路上皮细胞亚群间的主要通信通路进行预测,Bc 3细胞能够通过PTN与ncWNT信号通路影响其它细胞亚群,而Bc 1和Bc 2细胞可以通过WNT通路作用于Bc 3细胞。此外,FGF、IGF以及GRN生长因子相关信号通路在膀胱上皮较为活跃,其中,Plxna4+上皮细胞则可以通过FGF以及IGF信号影响基底细胞;Sc 2伞细胞通过GRN信号影响调节自身生物学功能。6.新型ASPM+基底细胞参与膀胱上皮修复Cluster 6特异性表达ASPM基因因此命名为ASPM+尿路上皮基底细胞。免疫荧光结果显示,健康小鼠尿路上皮中低表达ASPM+细胞。尿路感染损伤修复期,基底层ASPM阳性细胞数量明显增加。实验结果示,ASPM基因缺失会影响膀胱上皮细胞的增殖速率。7.新型Plxna4+膀胱尿路上皮细胞参与膀胱上皮炎症反应Cluster 7特异性表达Plxna4基因因此命名为Plxna4+尿路上皮细胞。GSVA分析发现这种细胞与免疫联系密切。免疫荧光结果显示,小鼠、大鼠和人类膀胱尿路上皮中有一种浅表细胞表达Plxna4。实验结果示,Plxna4蛋白可以增强LPS引起的膀胱上皮细胞炎症因子IL6与TNFα的释放。研究结论与不足本研究中我们改良了一种膀胱尿路上皮单细胞悬液制备方法（已获专利,专利号ZL 2019 1 0959271.2）用以单细胞测序。在绘制了小鼠膀胱尿路上皮细胞转录图谱,为膀胱生物学特性及相应膀胱疾病提供了重要参考的同时,创新性鉴定出两种新的膀胱上皮细胞亚型——Plxna4+和ASPM+细胞。需要指出的是,由于从健康志愿者身上获得正常的膀胱尿路上皮难度较大,应用小鼠膀胱尿路上皮细胞样本进行测序是本研究的不足之处,为此我们Plxna4和ASPM进行同源比对,结果示小鼠Plxna4、ASPM基因与人类高度同源,结合膀胱尿路上皮细胞基因集变异分析与细胞功能实验验证结果:ASPM+影响尿路上皮细胞的增殖能力,Plxna4+上皮细胞参与细菌感染时宿主反应的启动。以上综合说明Plxna4、ASPM在指导临床膀胱尿路上皮细胞所致膀胱疾病中的重要作用。