神农香菊(Chrysanthemu indicum var.aromaticum)是近几年发现的野菊(Chrysanthemum indicum)一变种,其花、叶、根均具有浓郁的香气,可用于精油提取、药材加工,是一种极具药用开发价值和园林应用价值的植物。神农香菊主要的有效成分有两类:挥发油、黄酮类化合物。在类黄酮代谢途径中花色素苷生物合成途径是其重要分支,研究类黄酮代谢途径对园林植物花色的改良具有重大意义。MYB转录因子对植物类黄酮代谢途径有重要调控作用。本研究欲从神农香菊克隆得到一 MYB基因,通过转基因方法使CiMYB4在烟草中过量表达,初步探究CiMYB4基因的功能。再对野菊进行遗传转化,以期为菊花类黄酮代谢途径的调控网络提供参考,同时也为菊花花色创新提供理论依据。本研究以神农香菊为试验材料,在神农香菊转录组数据的基础上,分析筛选并克隆获得了CiMYB 基因,利用生物信息学方法对CiMYB4基因进行分析;双酶切方法构建植物过表达载体,对烟草进行遗传转化,初步探究CiMYB4基因的调控作用;再将CiMYB4基因转入野菊中,为后期在CiMYB4基因对野菊类黄酮代谢途径与花色变化的研究奠定基础。研究结果如下:1.RT-PCR克隆获得一个MYB基因开放阅读框(ORF),长度为846bp,编码281个氨基酸,将其命名为CiMYB4基因,该基因所编码蛋白质相对分子量31720.79,理论等电点(pI)为8.77,为不稳定蛋白,亲水性较强;多序列比对和系统进化树分析显示,CiMYB4蛋白在N端高度保守,分别具有R2、R3两个MYB结构域特征,为R2R3-MYB类转录因子。预测该基因有抑制表达作用。CiMYB4与向日葵、黄花蒿、莴苣、刺苞菜蓟的MYB转录因子亲缘关系较近,与黄花蒿MYB的同源性比对结果高达92%。CiMYB4基因在神农香菊不同组织部位中基因的表达量存在差异,该基因在叶中的表达量最低,在花中的表达量最高。2.双酶切CiMYB4基因,成功构建pBI121-CiMYB4植物过表达载体。利用基因枪法对CiMYB4基因进行洋葱表皮细胞亚细胞定位,显示CiMYB4基因表达在细胞核中。电转化法将pBI121-CiMYB4重组质粒和pBI121质粒导入农杆菌中,用农杆菌介导法转化烟草(Nicotia tabacum)。两次抗性生根筛选初步获得阳性植株、提取RNA用PCR进行检测排除假阳性,证明成功获得转CiMYB4基因和转pBI121空载体的阳性烟草株系。观察转基因烟草表型,发现过表达植株烟草花色变浅。选3个CiMYB4基因过表达株系,播种进行抗性筛选,得转基因T1代植株。qRT-PCR结果显示CiMYB4基因对类黄酮代谢途径相关基因表达具有抑制作用。3.利用农杆菌介导法将CiMYB4基因转入野菊,通过生根筛选初步获得转CiMYB4基因野菊的阳性植株。利用geNorm和NormFinder软件分析了 5种候选内参基因在野生型野菊根、茎、叶、花中的表达稳定性,获得在野菊不同组织中相对稳定表达的内参基因CmEF1α。用CmEF1α为内参引物以转CiMYB4基因野菊植株cDNA为模板进行荧光定量PCR检测,证明已成功获得CiMYB4基因过表达植株。