第一部分miR- 203在食管鳞癌中的表达检测及功能探讨研究背景食管癌是发生在食管粘膜上皮组织的肿瘤,是一类严重影响人类健康的高致死性肿瘤。其组织学类型主要包括腺癌、鳞状上皮癌和未分化癌,其中鳞状上皮癌在亚洲人中多见。食管癌患者的五年生存率低,所以早期诊断,早期防治显得尤为重要。探讨食管癌发生的分子机制,有望为食管癌的早期防预提供线索。miRNAs具有广泛多样的生物功能,参与一系列重要的生命进程,包括细胞分化,增殖和凋亡,早期发育,器官形成等。已有研究表明,miRNAs通过对细胞增殖、分化相关靶基因的调控,参与食管癌的发生发展。miR-203是与复层上皮组织分化密切相关的重要分子:Sonkoly等研究表明,在21种人类组织器官中,miR-203呈现为皮肤特异性表达,在角化细胞中表达最丰富,在食管和子宫颈部的表达高于其他组织,在正常食管复层鳞状上皮中更明显[1]。Yi等[2]科研人员发现,miR-203在上皮细胞分层分化的时候产生,它通过限制细胞的增殖潜能,诱导细胞周期阻滞,促进表皮分化,miR-203在脊椎动物中有一较保守的靶基因p63——复层上皮组织中维持基底层干细胞活性的调节基因。Feber等用芯片检测的方法,在1例食管鳞癌组织和7例正常食管上皮之间,及7例食管鳞癌组织和1例正常食管上皮之间,进行了miRNAs表达的比较,结果发现,miR-203在食管鳞癌中有2-10倍下调[3]。提示miR-203可能与食管鳞癌的发生相关。由于所检测组织样本较少,并不能完全反应miR-203在食管鳞癌中的表达情况,有必要在大样本中进一步检测。目的利用临床食管鳞癌组织样本,检测miR-203在食管鳞癌中的表达情况,检测miR-203所在CpG岛在食管鳞癌中的甲基化状态。在此基础上,初步探讨miR-203对食管鳞癌细胞的增殖及其下游靶基因△NP63蛋白的影响。方法与结果1).在93例食管癌肿瘤组织,38例非肿瘤组织中,用Taqman探针实时定量检测的方法,对成熟miR-203的表达进行了检测。93例肿瘤组织和38例非肿瘤组织相比,独立样本t检验表明,肿瘤组织中miR-203表达增高(p=0.006)。在38对配对组织样本中的检测结果表明,miR-203在55.3% (21/38)的肿瘤组织中高表达,在28.9% (11/38)的非肿瘤组织中高表达,在15.8% (6/38)的组织样本中表达无明显差异,采用配对样本t检验,两组样本差异显著(p=0.031)。2).在食管癌细胞株EC109上过表达miR-203,用CCK-8检测试剂,探讨了miR-203与食管癌细胞增殖之间的关系,结果表明,转染48h后,miR-203抑制EC109细胞的增殖。3).为了解miR-203的表达与其下游靶基因△NP63蛋白表达之间的联系,我们在17对肿瘤组织和非肿瘤组织中,用Western检测了△NP63的蛋白表达,结果表明,在11(64.7%)对样本中,非肿瘤组织中△NP63蛋白比肿瘤组织中表达高,在6(35.3%)对样本中,在肿瘤组织中的表达高。结论1、miR-203在多数食管鳞癌患者肿瘤组织中表达上调。2、在食管鳞癌细胞株EC109中,过表达miR-203,细胞增殖受到抑制。3、miR-203的靶基因△NP63在多数肿瘤组织中表达下调,可能是miR-203表达增高的结果。第二部分TCF4参与调控食管鳞癌中miR-203表达的研究研究背景正常生理状态下,食管基底层细胞不断向表层分化迁移,最后演化为复层鳞状上皮细胞,其更新速率与表层细胞脱落维持平衡。食管鳞状上皮生理条件下的更新模式,和表皮的更新有相似之处。miR-203可以抑制表皮基底层细胞的干性,它的表达失调可能导致食管上皮的正常更替失去平衡,了解其表达失调的发生机制,有助于了解食管鳞癌发生的分子机制。生物信息学分析提示,转录因子TCF4可以与miR-203的启动子区域结合,可能参与其上游转录调控。TCF4是经典Wnt信号通路的效应分子。研究表明,TCF3和TCF4对表皮长期稳态的维持、损伤修复至关重要,它们既接受Wnt信号传递的信息,也受非Wnt信号的调控[4]。TCF4具有较多可变剪接体,不同的剪接产物,可编码产生蛋白大小不同的异构体。主要差异体现在:长片段异构体上有两个C末端结合蛋白(C-terminal binding protein, CtBP)的结合位点,短片段异构体因翻译提前终止,不含上述结合位点。对TCF4长短异构体对靶基因转录的影响,已有研究存在争议,Andreas等[7]研究认为,代表性长片段异构体促进基因转录,短片段异构体则不能,Tsedensodnom等[8]则提出,代表性短片段异构体促进基因转录,长片段异构体则抑制基因转录。以往对食管癌中Wnt信号通路的研究,多集中探讨β-catenin的活化入核及功能5,6],较少关注TCF4不同异构体在食管鳞癌中的表达及功能情况,也还未见TCF4参与调控miR-203表达的研究报道。目的1.探讨TCF4是否参与食管鳞癌中miR-203的表达调控。2.明确TCF4在食管鳞癌肿瘤组织、非肿瘤组织中的蛋白表达情况。3.明确TCF4不同异构体对miR-203表达影响是否存在差异。方法与结果1).我们首先检测了TCF4在食管癌细胞株中的蛋白表达,western结果表明,TCF4长短异构体在KYSE150、KYSE450、EC109、EC9706上均有表达。为明确TCF4能否与miR-203启动子区域结合,我们在EC109细胞中进行了ChIP实验,结果证实:TCF4可以与miR-203上游调控区域结合。荧光素酶报告基因实验结果表明,当miR-203上游TCF4结合位点突变后,荧光素酶的转录活性增强。2).在21例食管癌肿瘤组织,21例非肿瘤组织中,我们用Western检测方法,对TCF4的表达进行了检测,结果表明,58kD短片段异构体在肿瘤组织和非肿瘤组织中均有表达,79kD长羧基末端异构体在21例(0/21)肿瘤组织中不表达,在85.7% (18/21)的非肿瘤组织中有表达,3).我们构建代表性长片段、短片段异构体质粒,转染至EC109细胞中,检测结果表明,长片段异构体抑制miR-203表达,短片段异构体促进miR-203表达。结论1. TCF4长短异构体在食管癌细胞KYSE150、KYSE450、EC109、EC9706中均有表达。2.在食管癌细胞EC109中,TCF4参与miR-203的转录调控,主要起转录抑制作用。3. TCF4长羧基末端异构体在食管癌肿瘤组织中不表达,在非肿瘤组织中表达,短片段异构体在两类组织中均有表达,说明TCF4蛋白表达状态在食管癌肿瘤组织、非肿瘤组织中存在显著差异。4. TCF4长羧基末端异构体抑制miR-203表达,短片段异构体促进miR-203表达,说明TCF4不同异构体对miR-203表达的影响存在差异。多数食管鳞癌患者肿瘤组织中miR-203的表达上调,可能由TCF4长羧基末端异构体的不表达所致。综上,本研究以miR-203为切入点,首先明确其在食管鳞癌患者中的表达情况,结果显示miR-203在多数食管鳞癌患者肿瘤组织中表达上调。随后从转录水平探讨了miR-203在食管鳞癌中的表达调控机制,证实TCF4参与miR-203的转录调控。发现TCF4蛋白在食管癌肿瘤组织和非肿瘤组织中存在异构体表达上的差异。TCF4长羧基末端异构体仅在非肿瘤组织中表达,而在食管鳞癌组织中不表达。TCF4长异构体抑制miR-203表达,TCF4短异构体促进miR-203表达。TCF4这种蛋白异构体形式的表达差异,可能是导致miR-203表达上调的部分原因,以致食管复层上皮组织自身所建立的平衡被打破,导致食管鳞癌的发生。本研究为理解食管鳞癌发生的分子机制提供了新的线索。