侧孢短芽孢杆菌A60激发子PeBL1鉴定和基因功能的研究

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在全球倡导无公害无污染的绿色有机农业形势下,应用生防菌防治植物病害越来越受到人们的关注。侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)是一类广泛应用的生防细菌,除了具有杀菌抑菌功能外,还可以诱导植物产生系统抗性,从而能抵御多种病害的侵染,但其诱导植物抗性的作用机制研究报道较少。本文从侧孢短芽孢杆菌A60菌株发酵液中分离纯化出一种蛋白激发子PeBL1。该激发子能诱导烟草的防御反应和系统抗性;克隆获得了PeBL1基因,并利用大肠杆菌(E.coli)表达系统成功获得有生物学活性的重组蛋白;利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术研究了PeBL1诱导烟草防御相关基因的表达,初步分析了该激发子诱导烟草产生系统抗性的信号转导途径。本研究对侧孢短芽孢杆菌A60菌株在生物防治领域的应用具有重要理论指导意义。具体结果如下:1.利用硫酸铵沉淀、阳离子交换层析、高效液相色谱等技术从侧孢短芽孢杆菌A60菌株发酵液中分离纯化出一种蛋白激发子PeBL1 (Protein elicitor from Brevibacillus laterosporus1)。PeBL1能够引起烟草叶片典型的过敏反应。PeBL1是非糖蛋白,在高温以及过酸过碱的条件下均失去活性。2.根据ESI-QTOF串联质谱结果,获得了一个匹配度最高的来自侧孢短芽孢杆菌的假设蛋白,功能未知,含有116个氨基酸,理论分子量为12833Da,确定该假设蛋白就是激发子PeBL1。并克隆得到了PeBL1基因(351bp)。成功构建了PeBL1-pET30原核表达载体,获得了可溶性表达的、有生物活性的重组蛋白。3.用PeBL1处理烟草后,会发生活性氧爆发,胞外碱化,酚类物质和木质素的积累等防御反应,并提高了烟草对TMV-GFP和Pseudomonas syringae pv. tabaci的系统抗性。对TMV-GFP病斑数量和大小抑制率最大分别达到42.91%和43.23%。对Pseudomonas syringae pv. tabaci的侵染抑制率在第四天达到了30%。4.实时荧光定量PCR (RT-qPCR)结果显示,PR-1α、PR-5、PDF1.2、NPR1、PAL出现了不同程度地上调表达,说明PeBLl诱导防御相关基因转录水平上调是其诱导系统抗性的重要机制之一。水杨酸途径标志基因PR-1α、PR-5和茉莉酸/乙烯途径标志基因PDF1.2诱导表达,初步阐明了PeBLl是通过水杨酸和茉莉酸/乙烯信号转导途径共同作用来诱导烟草产生系统抗性的。
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