目的:高压氧(Hyperbaric oxygen,HBO)治疗是指在高于当地压力的环境中,吸入高于当地大气氧浓度的氧来治疗疾病的办法。一般在空气加压舱内通过面罩或类似的其他装置吸纯氧(氧浓度大于95%),或者是在氧气加压舱内直接呼吸氧舱内的氧气。也就是患者在空气加压舱(或者氧气加压舱)内吸入纯氧,利用氧的物理、化学、生物及生理作用而达到治疗疾病的目的,就是HBO治疗。脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是指脑实质内原发的、非外伤性的出血,比重大约占急性脑血管病种的20%-30%,手术减压已成为公认的挽救ICH急性期患者生命最重要的急救手段。然而在如何改善手术前后缺血、缺氧以及脑水肿等方面的治疗仍然见效甚微。而脑水肿是ICH后,引起的继发性病理过程,脑水肿会进一步加重脑损伤,所以对脑水肿进行有效防治是促进神经功能恢复、降低继发性脑损害的重要和有效举措,因而减轻脑水肿已经成为临床上治疗ICH的重要环节。在大量临床研究中可见ICH后HBO治疗可减轻脑水肿,提高血氧张力和弥散距离帮助缺血半暗带保持活力,有利于其恢复功能,消除或改善功能障碍,减少后遗症。但目前尚缺乏循证医学的证据。水通道蛋白(aquaporins,AQPs)是一种细胞膜转运蛋白其与细胞的水通透性密切相关,在哺乳动物中已发现有13种AQPs。其中在脑内表达最多的AQP是AQP4,于室管膜细胞外侧基膜及星形胶质细胞膜表面等广泛存在。在脑水肿形成和消除及其病理生理过程中都发挥了非常重要的作用,调节其在脑内的表达对研究脑水肿的治疗具有重要的临床意义。基础研究表明,HBO可通过抑制脑出血后出血灶周围AQP4表达的水平,进而减轻ICH后脑水肿形成。且有研究发现,体内过量自由基会对细胞膜、蛋白质造成损伤,诱发细胞组织DNA突变,进而引发、加重人体多种疾患。而人体中超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)水平与自由基含量呈现负相关的对应关系,通过对SOD的检测,可以间接反映得到体内自由基的含量大小;HBO能够提高机体SOD含量水平,且SOD对免除自由基损伤、平衡机体氧化与抗氧化系统有至关重要作用。我们研究小组在前期实验中表明,脑出血大鼠治疗最佳治疗高压氧治疗压力是2.0ATA(Atmosphere absolute,ATA);脑出血后6小时是最佳介入时间,治疗吸氧时间是60min。本文在研究小组的基础上,主要对不同疗程HBO治疗对ICH后大鼠血肿周围水通道蛋白(Aquaporin-4,AQP4)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)表达的影响进行研究,从而就最佳ICH后高压氧治疗的疗程进行探讨。方法:1实验动物分组:52只雄性SD大鼠(按评分将未达标准的大鼠剔除),体重控制在250g~285g,饲养在河北医大二医院的神经病学实验室动物房内,给予标准饲料喂食,饮用实验室内自来水。动物由河北医科大学动物实验中心购买。模型成功后,对52只SD大鼠进行随机分组,区分为正常组(12只)、实验组(20只)和对照组(20只)。实验组大鼠根据高压氧治疗疗程不同区分为4个亚组:1周组、2周组、3周组和4周组,每组5只大鼠。实验组中各组大鼠分别在对应高压氧治疗周期结束后断头取脑保留部分脑组织留取标本;正常组(每个亚组3只)和对照组(每个亚组5只脑出血大鼠)饲养在正常环境中,不予任何干预措施,处死时间与实验组相同,之后留存标本。2脑出血动物模型制备:向大鼠右侧尾壳核内定位注射Ⅶ型胶原酶制备ICH模型。3神经功能的评定:在大鼠脑出血模型制备之后6小时,观察大鼠行为学及神经功能缺损评分方法进行神经功能缺损评分。按Longa FZ评分法法则进行评分:0分,无神经功能缺陷体征;1分,进针对侧肢体(左侧)不能完全伸展(为轻度局灶神经功能缺损);2分,向进针对侧转圈,进针对侧肢体瘫痪,有追尾现象(为中度局灶神经功能缺损);3分,向进针对侧倾倒,不能站立(为重度局灶神经功能缺损);4分,不能自发行走,昏睡等意识障碍。2分以上认为造模成功。4高压氧治疗:与术后6h对制备的模型大鼠进行评分,选择评分为2分以上的实验组大鼠。将动物放置于特制的木箱中,将木箱置于烟台冰轮高压氧舱内,压力设定为2.0ATA,加压30min,稳压前5min采用直排式给动物箱内充氧,氧流量设定为10L/min(稳压时测得木箱排气口氧浓度可达85%),稳压吸氧时间60min,然后减压20min出舱,结束治疗,1次/d。每周7次,根据实验分组分别治疗(1周、2周、3周、4周)。5评定方法AQP4测定:各组大鼠于脑出血后相应时间点处死取脑,经脑表面穿刺点冠状面切开标本,取穿刺点后3mm厚脑组织制备石蜡切片,采用免疫组化法观察AQP4的表达,阳性细胞为细胞膜或细胞浆呈棕黄色。采用Image Pro Plus 6.0全自动图像分析系统,测每高倍镜(10*40倍)视野内AQP4的吸光度,每只大鼠选择2张脑组织切片,每张切片选5个不同的视野,计算各组的平均光密度值(OD)。SOD测定:各组大鼠在相应时间点,处死取脑,取血肿周围脑组织液氮冷却,放-80℃冰箱保存,批量测定结果。测定时称重,加0.86%生理盐水配制,并用超声粉碎仪粉碎细胞,再离心(4000r/min)5-8min,取上清,按照使用说明书检测吸光度(OD)。6统计学处理实验结果采用SPSS19.0软件进行统计学分析处理。所有数据采用均数±标准差表示(x―±s),应用t检验进行两组间的比较,应用ANOVA对多组间的计量资料均数进行方差分析。检验水准α=0.05,P<0.05认为有统计学意义。结果:1脑组织的水含量变化:脑组织水含量测定的结果:与正常组相比,对照组1周末含水量开始增加,第2周达高峰、第3周逐渐下降,第4周基本恢复至正常水平。对照组第1周、第2周、第3周脑组织含水量均高于正常组,且差异有统计学意义(P<0.05)。第4周脑组织含水量与正常组相比差异不明显(P>0.05)。对照组组内比较:除第1周和第4周之间差异不明显外(P>0.05),其余各亚组之间相比均有统计学差异(P<0.05)。实验组各时间点脑组织水含量变化趋势与对照组一致,但较对照组相比均有降低,且差异有统计学意义(P<0.05)。4个亚组之间脑组织水含量虽然从数据上看每个时间点数值都有变化,但除了第1周、第3周、第4周与第2周相比均有差异(P<0.05)外,该三组之间差异不明显(P>0.05)详见Table 1。2大鼠脑组织AQP4表达的变化:与正常组相比,对照组大鼠在脑出血后第1周末AQP4表达开始增加,第2周达到顶峰,第3周开始逐渐下降,第4周基本恢复至正常水平。对照组第1周、第2周、第3周的脑组织AQP4的表达均高于正常组,且差异有统计学意义(P<0.05)。对照组第4周脑组织AQP4的表达与正常组相比差异不明显(P>0.05)。对照组中四个亚组之间相比均有统计学差异(P<0.05)。实验组各时间点AQP4表达变化趋势与对照组相一致,且较对照组相比均有所降低。且在第1周、第2周、第3周差异有统计学意义(P<0.05),但在第4周实验组与对照组之间差异不明显(P>0.05)。实验组4个亚组之间AQP4表达虽然在数据上看每个时间点数值均有变化,但第1周与第3周之间相比差异较小,无统计学意义(P>0.05),但该两组与第2周及第4周之间两两比较均有统计学差异(P<0.05)详见Table 2。3大鼠脑组织SOD表达的变化:高等动物细胞内只有两种SOD(Cu-Zn SOD、Mn-SOD)两者相加即为总SOD(T-SOD)。实验中经样本前处理过的样本中Mn-SOD活力丧失,但Cu-Zn SOD活力不变。T-SOD:与正常组相比,对照组T-SOD表达在前3周均增加,第2周表达达高峰,第4周表达活性下降至正常水平。对照组1周、2周、3周的T-SOD均高于正常组,且差异有统计学意义(P<0.05)。对照组第4周T-SOD与正常组相比差异不明显(P>0.05)。对照组内相比:1-3周各组之间相比无差异(P>0.05),但与第4周相比均有统计学差异(P<0.05)。实验组各时间点SOD表达变化趋势与对照组一致,但较对照组相比均有增加,且差异有统计学意义(P<0.05)。实验组4个亚组之间SOD表达,虽然从数据上看每个时间点数值都有变化,但除了第1周、第2周、第3周与第4周相比均有统计学差异(P<0.05)外,该3组之间相比无差异(P>0.05);Cu-Zn SOD:与正常组相比,对照组Cu-Zn SOD表达均增加,第3周表达最多。对照组各亚组的Cu-Zn SOD表达活性均高于正常组,且差异有统计学意义(P<0.05)。对照组相比:对照组各亚组之间相比无差异(P>0.05)。实验组各时间点Cu-Zn SOD表达变化趋势与对照组一致,但较对照组相比均有增加,且差异均有统计学意义(P<0.05)。虽然从数据上看每个时间点数值都有变化,但4个亚组之间相比差异不明显(P>0.05)。详见Table 3。结论:本文通过胶原酶诱导建立脑出血大鼠模型,并于术后6h给予大鼠不同疗程的高压氧(压力为2.0ATA,稳压吸氧时间60min,1次/d,分别给予1周、2周、3周、4周的治疗)治疗,并观察不同组别大鼠脑水含量、AQP4、SOD表达的变化规律。结果显示高压氧治疗可以通过下调AQP4表达,上调SOD表达,达到减轻脑水肿,清除自由基的作用,继而减轻脑出血后的脑损伤,改善神经功能,且以连续高压氧治疗4周为最佳疗程。