旋毛虫病(trichinellosis)是由旋毛虫(Trichinella spiralis)引起的一类危害严重的人兽共患寄生虫病。目前,诊断旋毛虫病主要是检测血清中抗旋毛虫抗体,但检测抗体不能很好地区分现症感染和既往感染。旋毛虫幼虫在宿主体内移行与发育过程中的排泄-分泌(excretory-secretory,ES)物进入血液中而成为循环抗原(circulating antigens,CAg),CAg在血液出现的时间早于抗体,其半衰期短于抗体的半衰期,对发病初期的患者或者应用激素治疗的免疫抑制者抗体检测阴性时也可检出CAg,尤其适用于早期诊断和疗效考核。　　 鸡卵黄免疫球蛋白(eggyolk immunoglobulin,IgY)是鸡血液中的IgG被选择性转移到卵黄中形成的,是卵黄中的唯一免疫球蛋白类,其结构与IgG相似,用作诊断抗体时可避免与类风湿因子等结合而发生交叉反应,比哺乳动物抗体具有更高的特异性,且IgY能与更多的抗原表位结合而起到信号放大作用,可提高血清学检测的敏感性。本研究制备了抗旋毛虫肌幼虫ES抗原的IgY并对其活性等进行了鉴定。　　 材料与方法　　 1.旋毛虫肌幼虫ES抗原的制备将人工消化后收集的纯净旋毛虫肌幼虫置于无血清的1640培养基中,在37℃,5％CO2培养箱中培养20h后,收集培养液,离心、透析和冷冻干燥浓缩后,得到纯化的ES抗原,考马斯亮蓝G-250(Bradford)法测定蛋白浓度,分装,保存于-80℃。　　 2.抗ES抗原IgY的分离提取将旋毛虫肌幼虫ES抗原免疫罗曼蛋鸡,收集鸡蛋,去除蛋清和卵黄膜后,蒸馏水10倍稀释卵黄液,4℃过夜,离心收集上清,硫酸铵沉淀,离心、透析和冷冻干燥浓缩后,得到IgY,Bradford法测定蛋白浓度,分装,保存于-80℃。　　 3.ES抗原免疫鼠血清的制备肌幼虫ES抗原免疫BALB/c小鼠,收集免疫血清,硫酸铵沉淀蛋白,离心、透析后即得免疫鼠血清IgG,Bradford法测定其浓度,间接ELISA测其抗体效价,分装,保存于-80℃。　　 4.IgY的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)将制备好的IgY经SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝染色后观察,TotalLab TL100软件分析蛋白条带分子量大小。　　 5.IgY的免疫印迹(Western blot)分析分别将ES抗原和旋毛虫肌幼虫虫体抗原进行SDS-PAGE电泳后,电转移至NC膜后,分别用免疫后IgY和免疫前IgY识别,显色后观察,TotalLab TL100软件分析蛋白条带分子量大小。　　 6.间接荧光抗体试验(IFAT)分别将免疫后IgY和未免疫IgY与旋毛虫肌幼虫冰冻切片反应,观察结果。　　 7.IgY效价和敏感性的检测间接ELISA检测IgY的抗体效价,IgY-夹心ELISA检测IgY的敏感性。　　 结果：　　 1.间接ELISA检测鸡血清抗体滴度确定间接ELISA最适条件,抗原最佳包被浓度为2.5μg/ml、血清的最佳稀释度为1:400、辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗鸡-IgG的工作浓度为1:500。间接ELISA检测结果表明,首次免疫后42d鸡血清中抗体OD值达到最高水平。　　 2.免疫鼠血清抗体滴度间接ELISA检测4次免疫后,鼠血清抗体滴度可达到1:105。将免疫鼠血清经硫酸铵沉淀、透析后,Bradford法测得血清IgG的蛋白浓度为0.433mg/ml,间接ELISA测其效价为104。　　 3.IgY的SDS-PAGE结果通过SDS-PAGE可见IgY有4条蛋白带,其中主要蛋白带为67 kDa和29kDa。　　 4.IgY的Western blot结果Western blot结果显示ES抗原可被免疫后IgY识别,主要蛋白带在为49、45、40kDa。虫体抗原也可被免疫后IgY识别,主要蛋白带为40、38、30、28、25 kDa。但两种抗原均不被未免疫IgY识别。　　 5.IgY的IFAT分析结果旋毛虫肌幼虫切片抗原与免疫后IgY,呈亮绿色荧光,判为阳性,而虫体切片与未免疫IgY为阴性反应。　　 6.IgY的效价和敏感性间接ELISA结果显示,免疫后38d的IgY效价达到1:107,IgY-夹心ELISA结果检测IgY可识别旋毛虫肌幼虫ES抗原的浓度为1.17ng/ml。　　 结论：　　 1.本实验成功制备了抗旋毛虫肌幼虫ES抗原的IgY抗体,可识别肌幼虫ES与虫体抗原,且具有较高的效价。　　 2.建立的IgY-夹心ELISA方法检测旋毛虫循环抗原具有高度的敏感性。