软骨损伤或缺失是临床上常见的问题，由于软骨的组织学和生物学特性限制了其自身的修复能力，目前尚缺乏有效的治疗措施。组织工程方法为软骨缺损的修复提供了一种全新的手段，利用支架材料为软骨细胞的增殖和基质分泌提供空间架构，形成类似正常软骨组织的结构，并行使功能。本实验研究了无支架组织工程软骨的构建、IGF-1和bFGF对软骨细胞增殖和基质合成及软骨形成的影响，并采用组织工程方法，以聚羟基乙酸和藻酸盐为软骨细胞支架，对关节软骨缺损的修复效果进行了组织学比较研究。 实验一 无支架体外软骨构建的实验研究 目的：观察在无支架条件下软骨细胞体外三维培养的软骨形成能力。 方法：Ⅱ型胶原酶消化法从兔耳获取软骨细胞，低速离心，在离心管底部形成直径约3mm，厚约1mm的软骨细胞团块，加入含10％FBS的DMEM培养液体外培养，分别于4、8和12周中止培养，进行大体观察、组织学和生物化学分析。结果：细胞团块较培养初始体积有增大变化，8周到12周时，外观呈半透明软骨样，H&E和阿尔新兰染色显示保持软骨细胞形态，位于软骨陷窝中，陷窝周围及陷窝间有酸性粘多糖合成，Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阳性表现，GAG含量分析显示软骨细胞保持增殖活性和基质合成能力。结论：软骨细胞团块能够为软骨细胞提供类似支架的三维生长环境，形成软骨样组织。 第四军区大学博士学位论X实验二 bFGF对软骨细胞增殖和基质形成的影响［摘要］目的：观察成纤维细胞生长因子比FGF）对软骨细胞增殖和细胞外基质合成的影响。方法：酶消化法从兔耳获取软骨细胞，与1．2％藻酸钠混合，细胞浓度 10’／ml，经注射器滴入 125tnM的 CaCI。溶液，形成软骨细胞／藻酸钙凝胶微球，用含 10％FBS的 DMEM培养液体外培养，培养液中分别加入ong／ffil、10ng／thl、50ng／ffil和 100ng／inl浓度的 bFGF。14天中止培养，进行生物化学分析。结果：ong／ml、10ng／inl、50ng／inl和 100ng／ffil bFGF浓度组体外培养14天后，单个微球的DNA总量平均为3．4pg、4．7pg、6石卜g和6．spg，GAG平均含量为15．4qg、20石卜g、29．7pg和对．lpg，单位DNA的GAG含量为4．47、4．39、4．50、4．55pg／pg。结论：bFGF明显促进了软骨细胞的增殖，GAG合成总量也得到明显提高，但单位DNA的GAG合成量无明显变化，表明bFGF对软骨细胞的影响主要体现在细胞增殖方面。实验三 bFGF对组织工程软骨构建的影响【摘要l 目的：复合bFGF和软骨细胞进行裸鼠皮下移植，研究bFGF对体内软骨形成的影响作用。方法：酶消化法从兔耳获取软骨细胞，与1．2％藻酸钠及50ng／ml的 bFGF混合，抽入注射器，加入 125InM的 CaCI。溶液，细胞终浓度5 X 10’／ml，立即行裸鼠背部皮下注射移植，每个部位注射 0．sml，对照组不加bFGF。分别于3、6周取材进行组织学观察和生物化学分析。结果：6周时，附加 bFGF组形成成熟软骨组织，而对照组软骨仍处于未成熟阶段，GAG含量测定显示实验组含量明显高于对照组。结论：bFGF在体内软骨的构建中，能够促进细胞的增殖和细胞外基质的合成，提高软骨形成速度。实验四！GFl、bFGF对藻酸盐微球中兔耳弹性软骨细胞增殖活性 和基质合成的影响【摘要】目的：利用藻酸盐微球体外培养兔耳弹性软骨细胞，观察IGFl、bFGF对细胞增殖和基质合成的影响及协同作用效果。方法：酶消化法从兔耳获取软骨细胞，与1二％藻酸钠混合，细胞浓度10’／Inl， 经注射器滴入125InM的CaCI。溶液，形成软骨细胞／藻酸钙凝胶微球，用含 10％FBS的 DMEM培养液体外培养，对照组不加生长因子，实验 A、B、C组分别加入 25ng／ml IGFl。 －3－ 第四旱区大学博士学位论文 50ng／ffil bFGF和 25ng／thl IGF＊60ng／thl bFGF，14天后中止培养，采用生物 化学方法分析微球中的细胞DNA和GAG总量。结果：对照组、IGF－l组、 bF份组和K3FK3F－1 ＋b＋bF他组单个微球的DN A总量分别为3．spg、3．6pg、6．2卜g 和6．4pg，GAG含量分别为15．spg、23．spg、29．opg和38．gpg。结论：这项 研究表明IGF－l和bFGF对软骨细胞的影响体现在不同方面，IGF－l可以提高 细胞GAG合成总量，但并不促进软骨细胞增殖，而bFGF主要体现在细胞增 殖方面，IGF．l与bFGF联合应用的协同作用效果明显好于因子的单独应用， 细胞增殖明显，GAG的含量也明显增加，表明不同生长因子的联合应用会产 生更理想的软骨形成条件。 实验五 聚羟基乙酸和藻酸盐复合软骨细胞修复关节软骨缺损的组织学 比较研究 【摘要］目的：比较聚羟基乙酸和藻酸盐复合软骨细胞修复关节骨软骨复合缺 损的效果，探讨组织工程方法修复关节软骨的可行性。方法：酶消化法从成年 新西兰免关节软骨获取软骨细胞，SX10’／ml密度接种到可降解的聚羟基乙酸 支架上或复合