鱼鳞酶溶性胶原蛋白的提取、特性及其二级结构的温度效应研究

来源 :华中农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:tp153c
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本文采用胃蛋白酶从草鱼鱼鳞中提取酶溶性胶原蛋白(PSC),通过考察提取介质、前处理、搅拌、料液比、提取次数及提取时间等影响因素来确定最佳提取工艺,并利用SDS-PAGE凝胶电泳、傅立叶红外光谱(FT-IR)和氨基酸组成分析对其类型进行确定,同时对鱼鳞PSC的溶解性、黏度特性和凝胶特性进行了系统研究。在利用乌氏黏度计和差示扫描量热仪(DSC)探讨了PSC的热变性温度(Td)的基础上,结合使用傅立叶红外光谱、拉曼光谱(Raman)和圆二色谱(CD)研究鱼鳞PSC二级结构的温度效应,并采用原子力显微镜(AFM)考察了浓度、pH、温度对鱼鳞胶原蛋白溶液聚集态的影响。其主要研究结果如下:1.草鱼鱼鳞PSC的最佳提取工艺为:蒸馏水浸泡5h后,微波辅助去杂,4%苹果酸脱钙,以0.50mol/L的苹果酸作为提取介质,料液比为1:10,提取过程加以搅拌,提取3次,每次48h。纯化后的鱼鳞胶原蛋白通过SDS-PAGE电泳、氨基酸组成和红外光谱分析,确定所提蛋白为典型的Ⅰ型胶原蛋白且达到电泳纯。2.草鱼鱼鳞PSC最易溶解于0.50mol/L乙酸中,且其最大溶解浓度达4.00mg/mL:在pH3时,PSC溶解度最大;NaCl浓度低于3%时,对草鱼鱼鳞PSC的相对溶解度影响很小,当NaCl浓度大于3%,随其浓度增加,PSC的相对溶解度显著下降。3.草鱼鱼鳞PSC的特性黏度为1.07L/g。增加PSC浓度和添加丙三醇、乙醇、聚乙二醇都能使PSC溶液表观黏度显著增加;添加葡萄糖和蔗糖都将使PSC溶液表观黏度缓慢增加,而添加NaCl和CaCl2都会引起PSC溶液表观黏度降低;PSC表观黏度在pH3时最大;随剪切速率的增大,PSC表观黏度下降;保温时间长短对PSC溶液的表观黏度影响不大。4.草鱼鱼鳞PSC的凝胶强度随其浓度增大和加热温度升高而增强,但加热时间延长,其凝胶强度显著下降;在凝胶形成的前4h,凝胶强度显著增加,到18h后,凝胶强度基本趋于稳定;添加NaCl和CaCl2都会使PSC的凝胶强度下降,而增大葡萄糖和蔗糖的添加量,鱼鳞PSC凝胶强度缓慢增加;丙三醇、乙醇、聚乙二醇对鱼鳞PSC凝胶强度影响的趋势基本一致,随其添加量增加,PSC凝胶强度降低,添加量进一步增加,则凝胶强度又开始增强。5.DSC分析表明PSC冻干品的Td为37.1℃,而乌氏黏度计测定草鱼鱼鳞PSC乙酸溶液的Td为32.0℃,这表明草鱼鱼鳞PSC冻干品比其乙酸溶液具有更高的稳定性。旋转流变仪测定鱼鳞PSC水溶液的变性温度(31.5℃左右)明显高于其苹果酸(25.4℃左右)和乙酸溶液(28.0℃左右),这说明草鱼鱼鳞PSC水溶液比其酸溶液更稳定,但其乙酸溶液的Td与乌氏黏度计的结果存在一定差异。此外,向鱼鳞PSC乙酸溶液中添加4%丙三醇、4%乙醇、4%聚乙二醇、5%葡萄糖、5%蔗糖,都能使PSC溶液的Td略有上升;而添加1.5%NaCl或2%CaCl2使PSC乙酸溶液的Td下降到22.0℃,这表明溶剂类型和添加剂种类对鱼鳞PSC溶液的Td都有一定的影响。6.FT-IR分析表明:草鱼鱼鳞PSC具有典型的胶原蛋白特征吸收带,酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ和酰胺Ⅲ带的特征吸收频率分别出现在1658cm-1、1552cm-1和1238cm-1处。随温度升高,酰胺A和酰胺B峰位向低波数移动,1658cm-1处吸收峰裂解成多个吸收峰;1552cm-1处的吸收峰在35℃微略红移,随后发生明显蓝移;1238cm-1处吸收峰随温度升高向低波数移动。在拉曼光谱中,胶原蛋白的酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ和酰胺Ⅲ带的特征吸收频率分别出现在1669cm-1、1557cm-1和1245cm-1处,都较红外光谱的波数高;此外,921cm-1和855cm-1处脯氨酸的特征谱峰在拉曼光谱中体现出来。圆二色谱分析可见,鱼鳞PSC溶液在221.6nm和204.4nm分别有一正、负峰,具有典型胶原蛋白三股螺旋结构的特征圆二色谱峰型。PSC冻干品的FT-IR和Raman谱线大都在35℃-60℃时发生波数和强度改变,而PSC乙酸溶液的园二色谱谱线在20℃-35℃之间发生剧烈改变。由此可以推断PSC在固态和溶液状态下,变性温度存在一定差异,PSC冻干品比其乙酸溶液更稳定。7.鱼鳞PSC在不同浓度、pH、温度条件下的溶液聚集态明显不同。在pH2.7的乙酸溶液中,在10μg/mL的低浓度时,鱼鳞PSC主要以单体和线性小聚集体形式存在;随着浓度增大,胶原分子开始组装形成网状结构,当浓度达到4.0mg/mL时,形成无规线团结构;而在pH7.2的Tris-HCl溶液中,即使在10μg/mL的低浓度下,鱼鳞PSC也能自组装成不规则的片状聚集体,并通过横向融合形成多孔网状结构,随着浓度增大,纤维直径和高度明显增加;浓度为1.0mg/mL的鱼鳞PSC溶液经40℃处理1h,胶原蛋白的聚集行为发生了明显改变,聚集体由线性变为球状,而采用80℃处理1h,其高级结构基本被破坏,AFM图像上只可见少许不规则分布的团状聚集体。
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