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实验目的:恶性肿瘤严重影响人类的健康。化学药物治疗,作为一种可提高癌症患者生存率并减少癌症复发的方法,在临床上常用于癌症的治疗。但是由于治疗过程中会出现耐药性和药物的副作用,影响化疗药物的治疗效果,因此,迫切需要开发更有效的药物。本实验探讨了本课题组合成手性噻唑烷二酮类化合物B6在体外细胞和体内的抗肿瘤作用和机制,为研发新型抗肿瘤药物及进一步研究噻唑烷二酮类化合物提供了参考。实验方法:MTT法检测化合物B6体外抗肿瘤活性并且比较不同构型的B6体外抗肿瘤活性;克隆形成实验检测(S)-B6对HCT116和HT-29细胞增殖的影响;倒置显微镜观察(S)-B6对HCT116和HT-29细胞形态的影响;LDH试剂盒检测(S)-B6对HCT116和HT-29细胞内LDH含量的影响;激光共聚焦观察(S)-B6对HCT116和HT-29细胞骨架的影响;流式细胞仪检测(S)-B6对HCT116和HT-29细胞内ROS含量和细胞周期的影响;透射电镜观察(S)-B6对HCT116和HT-29细胞内线粒体的影响;细胞划痕实验和Transwell实验检测(S)-B6对HCT116和HT-29细胞迁移能力的影响;免疫印迹法检测(S)-B6对HCT116和HT-29细胞焦亡相关蛋白(GSDMD、Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 9、GSDME)、线粒体相关蛋白(TOMM 20、Bax、Cytochrome C、Bcl-2)、细胞周期相关蛋白(CDK1、p-CDK1、Cyclin B1)、PPARγ蛋白、EMT相关蛋白(E-cadherin、Vimentin、MMP2)和通路蛋白(PTEN、Akt、m TOR、p-m TOR)等蛋白的影响;利用BALB/c小鼠腋下荷CT-26细胞构建体内实体瘤模型研究(S)-B6在体内的毒性、对原位瘤生长的影响及相关机制。实验结果:MTT实验结果显示,B6在体外能抑制人源慢性粒细胞白血病细胞株(K562)、人源乳腺癌细胞株(MDA-MB-231)、人源结肠癌细胞株(HCT116、HT-29)、鼠源结肠癌细胞株(CT-26)、人源宫颈癌细胞株(He La)和人源肝癌细胞株(Hep G2)的活性,其中对于结肠癌细胞株具有最好的抑制效果,并且对于人源正常肝细胞株(HL-7702)和人小肠上皮细胞株(FHs 74 Int)的影响较低。(S)-B6抑制人结肠癌细胞(HCT116、HT-29)的活性强于(R)-B6和RAC-B6.。克隆形成实验显示,(S)-B6能剂量依赖性抑制HCT116和HT-29细胞的增殖。倒置显微镜观察发现,(S)-B6使HCT116和HT-29细胞发生肿胀,释放内容物;激光共聚焦技术观察,(S)-B6破坏HCT116和HT-29细胞的骨架;LDH试剂盒检测,(S)-B6能引起HCT116和HT-29细胞内LDH含量升高;免疫印迹法检测,(S)-B6能剂量依赖性上调HCT116和HT-29细胞Cleaved Caspase 3和GSDME-N蛋白的表达,通过以上结果确定(S)-B6可以诱导HCT116和HT-29细胞焦亡。流式细胞仪技术检测发现,(S)-B6能引起HCT116和HT-29细胞内ROS含量的升高并且将细胞阻滞在G2/M期。透射电镜结果显示,(S)-B6能破坏HCT116和HT-29细胞线粒体结构。细胞划痕实验和Transwell实验证明(S)-B6能抑制HCT116和HT-29细胞的迁移能力。免疫印迹实验结果发现(S)-B6能剂量依赖性调控HCT116和HT-29细胞的线粒体相关蛋白、细胞周期相关蛋白、PPARγ蛋白、EMT相关蛋白以及相关通路蛋白。BALB/c小鼠腋下荷CT-26实体瘤模型结果发现,(S)-B6在体内具有较低的毒性,能抑制实体瘤的生长。免疫组化结果显示,(S)-B6体内抗肿瘤机制与体外细胞实验一致。实验结论:手性噻唑烷二酮化合物B6作用于结肠癌细胞后,作为PPARγ配体,经PTEN-Akt-m TOR通路,在线粒体内产生过量ROS,通过活化Caspase 3,切割GSDME途径诱导焦亡,同时将细胞阻滞在G2/M期,还具有抑制细胞的迁移能力,最终发挥抗肿瘤作用。