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背景及目的结直肠癌是全世界范围内一种常见的消化道肿瘤,且近年来发病率表现出上升的趋势。明确结直肠癌的发病病因及分子机制,提高其早期诊断水平及治疗效果是结直肠癌研究的重点。microRNA(miRNA)是一类内源性的非编码单链小分子RNA,大量研究证据表明miRNA几乎参与了所有的生命活动,在细胞生长、发育、增殖、分化以及细胞凋亡等方面发挥调控作用。同时发现miRNA在肿瘤的发生发展机制中扮演了不可或缺的角色,已经成为分子肿瘤学研究的新热点。miRNA-200家族是近期研究较热的分子,有大量研究对miRNA-200家族与肿瘤发生发展关系及机制进行了研究,而miRNA-200家族与结直肠癌细胞的关系报道相对罕见。PI3K蛋白家族参与细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节。PI3K的激活导致质膜上产生第二信使PIP3,PIP3与AKT结合,导致AKT活化生成P-AKT,其通过磷酸化各种酶、激酶以及转录因子等下游因子调节细胞的功能,并发挥其抗凋亡作用。AKT也可以通过抑制蛋白水解酶Caspase-9的活性进而阻止凋亡级联反应的激活。近年来发现,PI3K及AKT所组成的信号通路在肿瘤的发生、发展、治疗及转归中均发挥着重要作用,并且己经成为肿瘤诊断及治疗的新靶点。随着miRNA研究的逐步深入,多项研究表明miRNA与PI3K-AKT通路之间存在着相关性,miRNA可以直接或者间接调节PI3K-AKT通路。也有研究表明miRNA-200c的表达可以诱导结直肠癌干细胞特性和PI3K-AKT通路的活性。因此miRNA-200家族、PI3K-AKT信号通路以及结直肠癌之间的相关性及分子机制有待进一步研究及明确。梓醇是地黄的主要活性成分之一,具有多种药理学作用,如利尿、导泻、降糖、保肝和抗衰老作用,亦有研究表明梓醇具有抗肿瘤作用。因此,结合上述研究基础及大量相关文献报道,我们确立了"梓醇对结直肠癌细胞HCT-116细胞株增殖、凋亡的影响及作用机制的研究"这一课题,研究目的是观察梓醇溶液对结直肠癌HCT-116细胞株细胞增殖及细胞凋亡的影响,并探讨其作用机制,进而确定梓醇在结直肠癌方面的治疗价值。方法1.应用不同浓度(0、25、50、100(μig/ml)的梓醇处理HCT-116细胞,置于37℃C、5%CO2细胞培养箱中进行培养,持续24h、48h和72h,应用酶联免疫检测仪(ELISA法)进行MTT试验检测HCT-116细胞的吸光度,计算细胞增殖率,以研究梓醇对细胞增殖的影响。2.HCT-116细胞经过不同浓度(0、25、50、100μg/ml)的梓醇处理48h后,利用Caspase-3及Caspase-9活性检测试剂盒检测Caspase-3及Caspase-9的活性,研究梓醇对HCT-116细胞Caspase-3和Caspase-9活性的影响。3.应用不同浓度(0、25、50、100μg/ml)的梓醇处理HCT-116细胞48h后,应用AnnexinV-FITC/PI双标法对梓醇诱导HCT-116细胞细胞凋亡的能力进行检测,用流式细胞仪测定细胞凋亡比率。4.应用DAPI染色试验检测不同浓度(0、25、50、100μμg/ml)的梓醇处理后HCT-116细胞的细胞核形态,应用荧光显微镜在紫外线下观察,设定在340nm波长处观察和拍摄HCT-116细胞细胞核的形态,研究梓醇对HCT-116细胞核形态方面的抗癌效果。5.应用WesternBlot法分析不同浓度(0、25、50、100μg/ml)的梓醇处理后HCT-116细胞中PI3K、p-AKT、AKT蛋白的表达,研究梓醇对PI3K-AKT信号通路的影响。6.应用荧光定量PCI技术检测不同浓度(0、25、50、100μg/ml)的梓醇处理HCT-116细胞48h后,采用TRIzol 一步法抽提细胞样品中的总RNA。按照High Capacity cDNA Reverse Transcription kit 试剂盒说明书的操作步骤,应用 ABI7500(TAKARA,日本)荧光定量PCI系统进行扩增,检测HCT-116细胞中miRNA-200的表达。7.将 PI3K 抑制剂(LY294002,5μM)添加到 HCT-116 细胞,重复 Western Blot测定HCT-116细胞中PI3K、p-AKT、AKT蛋白表达水平,重复荧光定量PCI技术以检测HCT-116细胞中miRNA-200的表达,与单纯梓醇处理组进行比较,研究下调PI3K-AKT信号通路后对梓醇抗肿瘤作用机制的影响。结果1.梓醇对细胞增殖的影响应用不同浓度(0、25、50、100μg/ml)的梓醇处理HCT-116细胞,持续24h、48h和72h,进行MTT试验检测HCT-116细胞的吸光度。结果显示HCT-116细胞的吸光度明显降低,表明梓醇处理后HCT-116细胞株的细胞增殖被抑制,而且抑制效率是剂量和时间依赖性的。2.梓醇对HCT-116细胞Caspase-3和Caspase-9活性的影响当HCT-116细胞经过处理48h时,与对照组(0μg/ml的梓醇组)相比,浓度为50、10Oμg/ml梓醇溶液处理组与对照组比较Caspase-3和Caspase-9的活性水平在统计学上有显著性差异(p<0.05),说明Caspase-3和Caspase-9活性均明显提高且均呈剂量依赖性关系。3.梓醇诱导HCT-116细胞凋亡的影响应用不同浓度(0、25、50、100μg/ml)的梓醇处理 48h 后,Annexin V-FITC/PI双染标记法检测细胞凋亡情况,各浓度处理组HCT-116细胞都发生了一定程度的凋亡,与对照组(0μg/ml的梓醇组)相比,浓度为25、50、100μg/ml梓醇处理后的早期凋亡(右下象限)及晚期凋亡(右上象限)细胞百分比均显著提高,其中浓度为50、100μg/ml梓醇溶液处理组与对照组比较凋亡百分比的提高存在统计学意义(p<0.05),说明凋亡率明显提高且呈剂量依赖性关系。4.梓醇对HCT-116细胞核形态的影响应用不同浓度(0、25、50、100μg/ml)的梓醇溶液处理HCT-116细胞48小时后,荧光显微镜下观察,可见梓醇(50或100μμg/ml)影响了 HCT-116细胞的核形态,呈现出典型的凋亡细胞特征,说明与对照组相比,梓醇显著加速了 HCT-116细胞的细胞核凋亡。5.梓醇对PI3K-AKT信号通路的影响经过不同浓度(0、25、50、100μg/ml)的梓醇处理48h后,应用Western Blot法检测了 PI3K、p-AKT及AKT蛋白的表达,与对照组(Oμg/ml的梓醇组)相比,浓度为25、50、100μg/ml梓醇处理后HCT-116细胞的PI3K、p-AKT及AKT蛋白的表达均较前减少,其中浓度为50、100μg/ml梓醇溶液处理组与对照组比较在统计学上有显著性差异(p<0.05),表明梓醇对PI3K-AKT信号通路起到抑制作用。6.梓醇对HCT-116细胞miRNA-200表达的影响经过不同浓度(0、25、50、100μg/ml)的梓醇处理48h后,我们应用荧光定量PCR技术检测了 HCT-116细胞中miRNA-200的表达,与对照组(Oμg/ml的梓醇组)相比miRNA-200的表达增加,其中浓度为50、1OOμg/ml梓醇溶液处理组与对照组比较在统计学上有显著性差异(p<0.05)。7.梓醇处理时下调PI3K-AKT信号通路对PI3K-AKT表达及细胞增殖的影响将PI3K抑制剂(LY294002,5μμM)添加到HCT-116细胞中,与单纯梓醇(5μg/ml)处理组相比,PI3K抑制剂+梓醇处理组进一步阻断了 HCT-116细胞中PI3K-AKT信号通路,抑制了 PI3K和p-AKT蛋白质的表达。同时,与单纯梓醇(50μg/ml)处理组相比,同时下调PI3K-AKT通路有效地增强了梓醇对HCT-116细胞的抗增殖作用。8.下调PI3K-AKT信号通路对HCT-116细胞中miRNA-200表达的影响在将PI3K抑制剂(LY294002,5μM)添加到HCT-116细胞,下调PI3K-AKT信号通路后,测定HCT-116细胞中miRNA-200的表达水平,显示与单纯梓醇(50μg/ml)处理组相比,下调PI3K-AKT后,PI3K抑制剂+梓醇处理组显著增强了HCT-116细胞中miRNA-200的表达。结论1.MTT试验检测发现梓醇能够抑制结直肠癌HCT-116细胞株的细胞增殖。2.梓醇溶液能够提高结直肠癌HCT-116细胞株中Caspase-3和Caspase-9的活性,提示梓醇可能具有促进细胞凋亡的作用。应用AnnexinV-FITC/PI双染标记法发现梓醇处理后HCT-116细胞发生细胞凋亡,且荧光显微镜下观察见其核形态呈现出典型的凋亡细胞特征。3.梓醇处理后HCT-116细胞的PI3K、p-AKT及AKT蛋白的表达均较前减少,表明梓醇对PI3K-AKT信号通路起到抑制作用;HCT-116细胞中miRNA-200的表达增加,提示梓醇对HCT-116细胞的抗肿瘤作用可能与miRNA-200家族有关。4.将PI3K抑制剂(LY294002,5μM)添加到HCT-116细胞,发现与单纯梓醇处理组进行比较,HCT-116细胞中PI3K、p-AKT、AKT蛋白表达水平进一步降低,miRNA-200的表达显著增强,表明PI3K抑制剂可以进一步抑制PI3K-AKT信号通路,并增加了 miRNA-200家族的表达,提示其可能与梓醇抗肿瘤作用机制有关。