研究背景及目的：近来研究证明，将镇痛相关基因导入中枢神经系统能取得较好的镇痛作用，这为晚期癌症患者和慢性疼痛患者带来了希望。重组腺相关病毒是目前认为最安全的病毒载体，在许多疾病的治疗中都得到应用。但在疼痛治疗领域研究较少。本研究拟构建含人前脑啡肽原基因(humanpreproenkephalin，hPPE)的重组腺相关病毒2型(recombinantadenoassociatedvirustype2，rAAV2)载体rAAV2/hPPE。观察其对不同神经细胞的感染特性及转染此病毒后hPPE基因的表达。将此病毒载体注射到慢性疼痛模型大鼠体内，观察rAAV2介导的hPPE体内转染的镇痛作用。 方法： 1.重组人前脑啡肽原基因腺相关病毒载体的构建：从pCMV-hPPE质粒上克隆hPPE基因，构建到质粒骨架上含有新霉素抗性基因表达盒的质粒pSNAV上得到重组,pSNAV-hPPE，将此重组质粒转染BHK21细胞后，用G418筛选培养形成稳定携带rAAV2载体的混合细胞株BHK-SH1；再用HSV1-rc/△UL2感染、包装此细胞株并收获病毒rAAV2/hPPE。用SDS-PAGE电泳测定蛋白质纯度，用Southernblot测定病毒滴度。 2.用阳性对照病毒rAAV2/eGFP分别感染体外培养的星形胶质细胞、神经元和神经干细胞，观察rAAV2对这三种细胞的转染率，用5％血清诱导转染后的神经干细胞，观察rAAV2感染对神经干细胞的分化、传代的影响；用rAAV2/hPPE感染上述三种细胞，RT-PCR方法检测细胞感染后目的基因hPPE的表达，用放射免疫方法测定细胞培养液中L-EK的含量。 3.将阳性对照质粒rAAV2/eGFP分别经蛛网膜下、尾静脉和骨骼肌注射到大鼠体内，观察rAAV2对大鼠不同组织感染的情况，将rAAV2/hPPE经上述三种途径注射到慢性挤压伤(chronicconstrictioninjury，CCI)疼痛模型大鼠体内，测痛并观察注射后大鼠感觉异常和痛觉过敏的变化，用RT-PCR方法测定大鼠注射后各组织hPPE的表达，用放射免疫方法测定大鼠器官组织中亮氨酸-脑啡肽(L-EK)的含量。 结果： 1.获得了高滴度(2.5×1012v.g./ml)和高纯度的病毒颗粒； 2.细胞转染rAAV2/eGFP的结果显示rAAV2在神经元和神经干细胞中转染效率较高，于7～10天达到高峰，而对星形胶质细胞的转染效率较低；病毒转染后神经干细胞的生物学特性未发生改变。神经干细胞经分化、传代后eGFP的表达未受影响；和未转染的细胞相比，转染rAAV2/hPPE后，各细胞hPPEmRNA的表达均增高，培养基上清中L-EK的含量显著性增高[星形胶质细胞：154±5Vs98±3(P＜0.01)；神经元：377±9vs112±5(P＜0.01)；神经干细胞：298±13Vs74±6(P＜0.01)]。 3.大鼠经静脉注射rAAV2/eGFP可使血管、骨骼肌等组织表达绿色荧光，经脊髓注射和骨骼肌注射，仅在注射部位周围发现荧光表达；和对照组相比，不同途径注射rAAV2/hPPE均能提高CCI大鼠的机械刺激和热痛刺激的缩爪阈值；经脊髓或骨骼肌注射rAAV2/hPPE，大鼠注射部位的组织内hPPEmRNA表达增高，L-EK的含量增高[分别为235.0±25.5vs61.3±1.8(P＜0.01)；209±13vs0(P＜0.01)]。和对照组比，经尾静脉注射的大鼠hPPEmRNA的表达和L-EK的含量在脊髓、骨骼肌和血管壁均升高[L-EK含量分别为113.9±13.1vs61.3±1.8(P＜0.05)；211.1±2.5Vs2.3±0.8(P＜0.01)；121±25Vs0(P＜0.01)]。 结论： 1.重组人前脑啡肽原基因腺相关病毒2型载体能高效转导神经元和神经干细胞，使之高表达L-EK。 2.通过蛛网膜下、尾静脉和骨骼肌三种途径将rAAV2/hPPE注射到CCI大鼠体内，均能获得较好的镇痛效果。