[背景]随着世界经济的发展,人们生活水平的提高,全球人类健康面临的糖尿病威胁正日益增加,已成为严重威胁人类健康的世界性公共卫生问题,也给个人、家庭和社会带来了极大的经济负担。早期预防、早期干预无疑是解决这类问题的理想措施。2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者占全部糖尿病患者的绝大多数,其发病机制复杂,至今未被完全阐明。T2DM的发病基础是胰岛素抵抗和胰岛素分泌缺陷,但谁起主导作用仍存争议。过去认为胰岛素抵抗占主导地位,近来,越来越多研究提示胰岛素分泌缺陷在T2DM的发生发展中起重要作用。前期研究提示高糖、高脂能破坏胰岛β细胞的分泌功能和减少胰岛β细胞量,所以与胰岛素分泌缺陷关系密切。近期研究提示2型糖尿病是一种慢性低度炎症性疾病。作为炎症过程的重要调节因子,白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)与2型糖尿病的关系日益引起重视。IL-1β不仅是由脂肪细胞、巨噬细胞、内皮细胞产生和分泌的,而且胰岛β细胞自身具有分泌IL-1β的功能。IL-1β具有广泛的生物学效应,在介导β细胞损伤中起着重要作用。一方面IL-1β抑制胰岛素的合成与释放；另一方面IL-1β促进胰岛β细胞的死亡。IL-1β不但介导白细胞间的相互作用,还参与了其他细胞的调节,并与其他细胞因子相互影响,相互制约,构成一个复杂的细胞因子调节网络,进一步加重胰岛β细胞的损伤。因此,在目前T2DM的治疗过程中,抑制IL-1β对胰岛β细胞的损伤作用对维持一定数量有功能的胰岛p细胞,延缓糖尿病的发生发展十分重要。胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是1983年在分析胰高血糖素的前体基因--胰高血糖素原(proglucagon, GP)基因序列时被发现的。该基因可在胰腺的α细胞、肠道的L细胞内表达。GLP-1由30个氨基酸组成,主要的生物活性型是GLP-1(7-36)。它的受体广泛分布于全身各个组织器官,被激活后产生多种生物学效应。GLP-1受体激动剂对胰腺本身产生的生物学效应：一方面增加胰岛素的分泌和合成功能,另一方面可以增加胰岛β细胞量,主要表现为增加胰岛β细胞的增殖、增加胰岛β细胞的新生、抑制胰岛β细胞的凋亡近期研究提示,GLP-1可以抑制高糖诱导的人胰岛β细胞和大鼠胰岛β细胞株INS832／13细胞的凋亡,其机制主要是GLP-1激活的PI-3K/PKB通路,诱导抗凋亡基因IAP-2(inhibitor of apoptosis protein-2)和BCL-2的表达增加。T2DM患者胰岛β细胞内IL-1β的表达显著高于正常对照组,进一步研究发现高糖和IL-1β自身能增加胰岛内IL-1β的表达,且与NF-κB的激活有关,而IL-1受体拮抗剂(IL-1 receptor antagonist, IL-1Ra)能显著抑制IL-1β的表达。提示高糖和IL-1β自身可以刺激胰岛β细胞生成和分泌IL-1β。研究表明,表儿茶精(epicatechin)能通过阻断NF-κB信号通路的激活,抑制IL-1β对胰岛β细胞系RINm5F和大鼠胰岛的细胞毒性。另外,通过包含IκB抑制剂的腺病毒转染β细胞系、大鼠及人的胰岛均能降低由IL-1β引起的细胞凋亡。IL-1β可以激活大鼠胰岛NF-κB信号通路,诱导COX-2和前列腺素受体3(EP3)基因的表达增加,导致胰岛β细胞的分泌功能下降,而水杨酸钠可以通过抑制IL-1β对NF-κB信号通路的激活,恢复胰岛β细胞的分泌功能。说明NF-κB通路的激活与IL-1β诱导的胰岛β细胞损伤关系密切。前述提示,T2DM是一个慢性低度炎症性疾病,其胰岛内局部IL-1β表达增加,这可能与高糖和胰岛自身分泌的IL-1β诱导有关,而NF-κB通路的激活与IL-1β诱导的β细胞损伤关系密切。GLP-1能抑制高糖对胰岛p细胞的损伤作用,这是否与GLP-1抑制IL-1β对胰岛β细胞的损伤作用有关呢?其机制是否与抑制IL-1β诱导NF-κB的激活有关呢?目前这方面的研究较少。本课题以大鼠胰岛细胞瘤系INS-1细胞为研究对象,观察GLP-1对IL-1β诱导INS-1细胞损伤的保护作用并探讨其部分保护机制。以期为GLP-1在2型糖尿病治疗中的应用提供更多的理论支持。具体研究内容分为以下两个部分：第一章GLP-1对IL-1β诱导INS-1细胞损伤的保护作用[目的]观察GLP-1对IL-1β诱导INS-1细胞损伤的保护作用。[研究对象和方法]1、以大鼠胰岛细胞瘤株INS-1细胞为实验对象；2、实验分组IL-1β浓度梯度分组(4组)第1组：0ng/ml rIL-1β干预INS-1细胞组,简称0组；第2组：1ng/ml rIL-1β干预INS-1细胞组,简称1组；第3组：5ng/ml rIL-1β干预INS-1细胞组,简称5组；第4组：lOng/ml rIL-1β干预INS-1细胞组,简称10组。各干预组分组(3组)第1组：正常对照组(Untreated group),以下简称对照组；第2组：lOng/ml rIL-1β干预INS-1细胞组,以下简称IL-1β组；第3组：在lOng/ml rIL-1β干预INS-1细胞前,予以hGLP-1预处理18小时,且间隔12小时追加一次相同剂量的hGLP-1,以下简称GLP-1+IL-1β组。3、胰岛素放免试法检测各组INS-1细胞胰岛素量：在干预结束后,各组细胞先用0mM糖KRHB缓冲液冲洗两遍,再依次用含0mM糖、2.5mM糖、15mM糖的KRHB缓冲液分别孵育30min、1h、1h。收集上清用于胰岛素放免测定。测定各组蛋白含量,用于均衡各组胰岛素分泌量。4、四氮唑蓝(MTT)法检测各组细胞活力：各组细胞干预结束后,分别经MTT、二甲亚砜处理,酶标仪检测各孔490nm处的光吸收值(OD值)。结果以正常对照组0D值标化余各组OD值,即设定正常对照组细胞活力为100%,由此计算余各组细胞活力百分比。5、统计学处理：采用SPSS13.0统计软件进行分析,实验数据以均数±标准差(x±s)表示,多组资料比较采用独立样本t检验、单向方差分析(One-way ANOVA)和协方差分析,进一步多重比较采用LSD法(Least-significant difference test),方差不齐性时,用Welch法校正,当P<0.05时用Games-Howell法作多重比较。P<0.05被认为差异具有统计学意义。[结果]1、各组分泌功能的比较在2.5mmol／L葡萄糖KRHB溶液中,与对照组相比,INS-1细胞的分泌功能较其它组略有下降,但各组间和组内比较均无统计学差异(P>0.05)在15mmol/L葡萄糖KRHB溶液刺激下,与对照组(29.806±1.173 ng/mg/h)相比,IL-1β组的胰岛素分泌功能(16.335±0.724 ng/mg/h)显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)；与IL-1β组(16.335±0.72432 ng/mg/h)相比,GLP-1+IL-1β组的胰岛素分泌功能(26.335±2.609 ng／mg／h)显著增强,差异具有统计学意义(P<0.05和P<0.01 ng/mg／h)2、不同浓度IL-1β和干预时间对INS-1细胞活力的影响不同浓度IL-1β干预INS-1细胞24小时后,与对照组相比,5 ng/ml组、10ng/ml组细胞活力分别下降18%、22%,差异均具有统计学意义(P<0.001),但5ng／ml组和10ng/ml组相比无统计学意义(P>0.05)；不同浓度IL-1β干预INS-1细胞48小时后,与对照组相比,1ng/ml组、5 ng/ml组、lOng/ml组细胞活力分别下降14%、25%、34%,差异具有统计学意义(P<0.001)；与1ng/m1组相比,5 ng／ml组细胞活力下降11%,差异具有统计学意义(P<0.05),,10ng/ml组细胞活力下降19%,差异具有统计学意义(P<0.01)；与5ng／ml组相比,10ng／ml组细胞活力下降8%,差异具有统计学意义(P<0.05)。与24小时10ng／ml组相比,48小时10ng／ml组细胞活力下降了11%,差异有统计学意义(P<0.05)。3、各组细胞活力的比较实验终点测定细胞活力,与对照组相比,IL-1β组细胞活力下降29%,差异具有统计学意义(P<0.001)；与IL-1β组相比,GLP-1+IL-1β组上升了30%,差异具有统计学意义(P<0.001)。[结论]1、IL-1β能够显著的抑制INS-1细胞的分泌功能,减少INS-1细胞的数量,且呈剂量依赖性和时间依赖性。提示IL-1β对INS-1细胞存在着显著的损伤作用。2、GLP-1能显著改善IL-1β对INS-1细胞功能的抑制,增加INS-1细胞的数量。提示GLP-1能够减轻IL-1β对INS-1细胞的损伤作用。第二章GLP-1保护IL-1β诱导INS-1细胞损伤的机制初探[目的]初步探讨GLP-1对IL-1β损伤INS-1细胞的保护机制。[研究对象和方法]1、以大鼠胰岛细胞瘤株INS-1细胞为实验对象；2、实验分组第1组：正常对照组(Untreated gloup),以下简称对照组；第2组：10ng/ml rIL-1β干预INS-1细胞组,以下简称IL-1β组；第3组：在10ng/ml rIL-1β干预INS-1细胞前,予以hGLP-1预处理18小时,且间隔12小时追加一次相同剂量的hGLP-1,以下简称GLP-1+IL-1β组；3、采用荧光定量(real time) PCR法检测各组IKKβ和PDX-1 mRNA水平4、免疫印迹法(Western blot)检测NF-KB蛋白在细胞核内表达5、统计学处理：采用SPSS13.0统计软件进行分析,实验数据以均数±标准差(x±s)表示,多组资料比较采用单向方差分析(One-way ANOVA),进一步多重比较采用LSD法(Least-significant difference test),方差不齐性时,用Welch法校正,当P<0.05时用Games-Howell去作多重比较。P<0.05被认为差异具有统计学意义[结果]1、各组细胞IKKβmRNA的表达与对照组相比,IL-1β组的IKKβmRNA表达显著增加(1.967±0.091 VS 1±0),差异具有统计学意义(P<0.01)；与IL-1β组比,GLP-1+IL-1β组的IKKβmRNA表达显著降低(1.967±0.091 VS 1.287±0.084),差异具有统计学意义(P<0.01)2、各组细胞核内NF-κB蛋白表达水平与对照组相比,IL-1β组核内NF-κB蛋白水平显著增高(1.166±0.056 VS0.042±0.007),差异具有统计学意义(P<0.01)；与IL-1β组比,GLP-1+IL-1β组核内NF-κB蛋白水平显著减少(0.648±0.050 VS 1.166±0.056),差异具有统计学意义(P<0.01)[结论]GLP-1能够抑制IL-1β诱导INS-1细胞IKKβ的表达,同时减少转入细胞核内的NF-κB蛋白量。提示抑制NF-κB通路可能是GLP-1减轻IL-1β诱导INS-1细胞损伤的机制之一。