牛肉作为一种高蛋白、低胆固醇的肉类食品倍受人们青睐,其嫩度和风味可随着肌内脂肪含量的增加而得到改善。而动物脂肪的形成与沉积是受多种转录因子调控的复杂生理过程,与脂肪细胞的增殖分化密切相关。CCAAT增强子结合蛋白家族(CCAAT/enhancer-binding protein family, C/EBPs)是一类非常重要的转录因子,在脂肪细胞的增殖分化过程中起关键调控作用。目前,关于C/EBPs对牛成纤维细胞成脂转分化的影响及其调控机理仍不清楚。为了探索牛C/EBPs基因的功能,本研究以C/EBPs家族中与脂肪细胞增殖分化有着紧密联系的3个成员——C/EBPα、C/EBPβ和C/EBP8为目标基因,以牛成纤维细胞为实验对象,以腺病毒介导的基因过量表达技术为手段,直接发掘3个目标基因诱导牛成纤维细胞转分化为脂肪细胞的潜在能力。同时,在转录水平上初步探索目标基因之间的相互调控作用,及其对一些重要的脂肪细胞分化相关基因的影响。主要研究成果如下：(1)成功克隆得到秦川牛C/EBPα、C/EBPβ和C/EBPδ基因的CDS区序列,其长度依次为1062bp、1047bp和771bp,分别编码353、348和256个氨基酸残基。序列信息分析结果显示,牛C/EBPs与人相应基因的氨基酸序列同源性分别达95%、97%和87%；牛C/EBPα和C/EBPβ分别在第233-252位,第190-208位氨基酸区域存在由外向内的显著跨膜结构,而C/EBPδ则在第125-141位氨基酸区域存在反方向的跨膜结构；牛C/EBPα、C/EBPβ和C/EBPδ都含一个有完全由α-螺旋构成的亮氨酸拉链,符合C/EBPs家族的一般结构特征。(2)构建了牛C/EBPα、C/EBPβ和C/EBPδ基因的腺病毒过表达载体,并包装获得了高滴度重组腺病毒,建立了适合于牛成纤维细胞的腺病毒过表达载体系统。(3)成功诱导了牛成纤维细胞向脂肪细胞的转分化。油红O染色结果显示,分别单一过量表达牛C/EBPα、C/EBPβ或C/EBPδ基因,可诱导成纤维细胞转分化为脂肪细胞或脂肪样细胞。同时过量表达2个或3个目标基因,也可诱导成纤维细胞转分化为脂肪细胞,且细胞的表型变化比单一表达时更明显。(4) Real-time PCR分析结果显示,过量表达C/EBPα或C/EBPβ基因可互相激活对方的转录表达,而都对C/EBPδ基因的表达无明显影响；过量表达C/EBPδ基因可在诱导细胞分化早期上调C/EBPα基因的mRNA表达量,而对C/EBPβ基因的表达无明显影响。同时过量表达C/EBPβ和C/EBPδ基因可在诱导细胞分化中期上调C/EBPβ基因的表达量。(5) Real-time PCR分析结果显示,过量表达C/EBPα或C/EBPβ基因可在诱导细胞分化后期,上调过氧化物酶体增殖激活受体-gamma (PPARγ)基因的mRNA表达量,而过量表达C/EBPδ基因对PPARγ基因的表达无明显影响；同时过量表达C/EBPβ和C/EBPα、C/EBPβ和C/EBPδ基因,也可在细胞分化后期上调PPARγ基因的表达量。单一或同时过量表达目标基因均对固醇调节元件结合蛋白-1(SREBP1)基因的表达无明显影响。(6) Real-time PCR分析结果显示,过量表达C/EBPα或C/EBPβ基因可上调脂肪细胞分化相关基因的mRNA表达量,如脂蛋白脂酶(LPL)、乙酰辅酶A羧化酶-α(ACCα)、脂肪酸合成酶(FAS)、硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)、脂肪酸转运蛋白-1(FATP1)和补体D (CFD)基因；而过量表达C/EBP8基因则仅可上调LPL、CFD和脂肪酸结合蛋白-4(FABP4)基因的表达量。同时过量表达2个或3个目标基因,均可上调除FATP1和FABP4以外的其他上述基因的表达量。(7)FABP4基因的mRNA表达量仅在单一过量表达C/EBPδ基因的细胞组中显著上升,而在过量表达C/EBPβ基因的细胞组中还有一定程度的下降,表明过量表达牛C/EBPβ或C/EBPδ基因,对FABP4基因在转录水平上的调控作用可能有所差异。综上所述,本研究利用腺病毒过表达技术介导牛C/EBPα、C/EBPβ和C/EBPδ基因过量表达,首次成功诱导牛成纤维细胞转分化为脂肪细胞或脂肪样细胞。同时,在转录水平上初步探索了这3个目标基因之间的相互作用关系,及其对一些重要的脂肪细胞分化相关基因的调控作用,为进一步研究牛体内脂肪的形成与沉积提供一定的理论依据,为下一步培育转基因牛的相关科研工作奠定基础。