多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida, Pm)是一种广泛流行于世界各地的病原菌,自然宿主十分广泛。在猪群中能够引起猪萎缩性鼻炎(Atrophic rhinitis, AR)和猪肺疫(Swine plague, SP),在禽、牛、羊以及家兔等动物中会引起出血性败血症(Haemorrhagic septicaemia, HS),给养殖业造成了巨大的经济损失。目前预防多杀性巴氏杆菌以免疫接种为主,疫苗类型主要分为以下几种：强毒灭活疫苗,弱毒活疫苗,亚单位疫苗。这些疫苗能在一定程度上对多杀性巴氏杆菌起到预防的作用,但是多杀性巴氏杆菌血清型很多,不同血清型菌株之间缺乏相互交叉的免疫保护,导致目前应用的疫苗免疫效果不够理想。随着分子生物学技术的广泛应用,利用病原菌的抗原蛋白制备的亚单位疫苗是当前疫苗研究热点,亚单位疫苗的理想抗原应该具有：抗原性高,免疫原性强,安全性高等特点。以往理想抗原的筛选较为困难,随着蛋白组学技术：2-DE电泳和质谱分析技术的发展,尤其是结合免疫印迹技术的免疫蛋白组学为筛选新型免疫保护性抗原,应用于研制新型高效亚单位疫苗提供了重要途径。蛋白组学技术的开发为寻找新型药物靶点、亚单位疫苗、微生物毒力因子等提供了快速方便的手段。因此,我们针对具有代表性的产PMT毒素血清D型多杀性巴氏杆菌HN06株的细菌表面蛋白进行免疫蛋白组学筛选,希望找到功能重要的免疫原性蛋白,为开发新型巴氏杆菌疫苗或研究其免疫机理作铺垫,本研究主要结果如下：1.HN06株表面免疫蛋白的筛选利用双向电泳将提取的多杀性巴氏杆菌HN06株表面蛋白进行分离,同时使用已制备好的感染血清、阴性对照血清与2-DE分离的表面蛋白进行Western blot杂交,将筛选到的阳性反应点进行质谱分析鉴定。本研究质谱分析共鉴定了4个新型免疫蛋白,分别为：三甲基胺-N-氧化还原酶(Trimethylamine-N-oxide reductase, TorA);延伸因子TS (Elongation factor Ts, EF-Ts);磷酸甘油变位酶(Phosphoglyceromutase, PGAM);过氧化物酶(Peroxiredoxin, Prx)。这4个蛋白均是在巴氏杆菌免疫蛋白组学研究中首次被发现。2.PGAM蛋白的表达与纯化PGAM为细菌产能代谢糖酵解关键酶,在细菌各种代谢途径中通过调控丙酮酸的生成从而控制三羧酸循环(Tricarboxylic acid cycle, TCA),进而调控细菌的生长与繁殖。本研究利用大肠杆菌原核表达系统,对PGAM蛋白基因gpmA与表达质粒pET-30a进行重组载体pET-30a-gpmA的构建：再导入原核表达菌株BL21。原核大量表达后,利用镊柱纯化表达的目的蛋白。将纯化后的蛋白与先前制备的感染血清进行Western blot,检测原核表达蛋白PGAM的生物活性,结果表明原核表达PGAM蛋白具有免疫活性。3. PGAM的免疫性及功能研究本研究通过PGAM蛋白对HN06株生长状况影响进行测定,发现PGAM蛋白能够促进细菌的生长；PGAM蛋白对Km小鼠免疫试验及免疫后巴氏杆菌攻击试验表明,PGAM蛋白能够诱导小鼠产生特异性ELISA抗体,抗体水平高；在小鼠免疫2次后,以HN06株10LD5o的剂量攻毒免疫后,PGAM蛋白试验组能够提供70%的保护力,而对照组几乎全部死亡,表明PGAM蛋白具有一定免疫保护性,可成为新型候选疫苗,为机体免疫理论的丰富进行铺垫。