【摘 要】
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目的:1.探究在静压力作用下,不同作用时间点的人牙龈成纤维细胞（HGFs）中CALR、CaN、NFAT3、p-NFAT3及COL-I的表达情况。2.探究沉默HGFs中CALR的表达后,CaN、NFAT3、p-NFAT3及COL-I的表达变化情况,分析CALR表达下调对HGFs中CaN/NFAT3信号通路的影响,以初步探究CALR在人牙龈纤维化转导信号通路中的作用及相关机制。方法:1.使用组织块培养
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目的:1.探究在静压力作用下,不同作用时间点的人牙龈成纤维细胞（HGFs）中CALR、CaN、NFAT3、p-NFAT3及COL-I的表达情况。2.探究沉默HGFs中CALR的表达后,CaN、NFAT3、p-NFAT3及COL-I的表达变化情况,分析CALR表达下调对HGFs中CaN/NFAT3信号通路的影响,以初步探究CALR在人牙龈纤维化转导信号通路中的作用及相关机制。方法:1.使用组织块培养法分离培养出原代HGFs,经传代纯化后,取第4-6代HGFs接种于PLGA支架上,建立三维HGFs-PLGA支架复合培养模型。2.采用重物加载法对构建成功的复合培养模型加载25g/cm~2静压力,根据加力的时间分为0h,6h,24h,48h,72h组,对照组为0h（未加力）组。通过RT-qPCR检测各加力组CALR、CaN及COL-I mRNA表达水平,通过Western Blot检测各加力组CALR、CaN、NFAT3、p-NFAT3及COL-I的蛋白表达水平。3.构建shRNA-CALR慢病毒表达载体,并将其转染入第4代HGFs,以沉默HGFs中CALR的表达,CCK-8法检测慢病毒载体转染对HGFs增殖能力的影响。转染72h后,荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光表达情况并计算转染效率,RT-qPCR和Western Blot验证CALR基因沉默效果。4.采用RT-qPCR检测沉默CALR的表达后,HGFs中CaN和COL-I的mRNA表达水平,Western Blot检测沉默CALR的表达后,HGFs中CaN、NFAT3、p-NFAT3及COL-I的蛋白表达水平。结果:1.体外成功分离培养HGFs,传代顺利,并完成HGFs-PLGA支架复合培养模型的构建。2.25g/cm~2静压力作用于三维复合培养的HGFs,CALR、CaN及COL-I的表达量迅速升高,在24h达峰值后,出现回落,但在72h时其表达量仍高于未加力组;同时,细胞内p-NFAT3表达量及p-NFAT3/NFAT3比值迅速下降,在24h达最低值后,开始升高,但在72h时其表达量仍低于未加力组。3.转染72h后,CALR沉默组（sh-CALR组）转染效率达89.486±0.025%,阴性对照组（sh-NC组）转染效率达87.775±0.015%,差异无统计学意义（P>0.05）。4.CCK-8结果显示,sh-CALR组、sh-NC组及空白对照组（Control组）的OD值均随培养时间的延长呈上升的趋势;比较相同天数的sh-CALR组、sh-NC组及Control组的OD值,差异均无统计学意义（p>0.05）。5.sh-CALR组HGFs中CaN、COL-I的表达量较sh-NC组及Control组明显下降,而p-NFAT3表达量及p-NFAT3/NFAT3比值较sh-NC组及Control组明显增高,差异均有统计学意义（p<0.05）。结论:1.当静压力作用于HGFs后,CALR、CaN、COL-I的表达及NFAT3的去磷酸化水平均上调,达峰值后逐渐降低。2.CALR基因沉默后,HGFs中CaN的活性受到抑制,使活化的NFAT3迅速磷酸化,同时下调COL-I的表达,其机制可能为沉默CALR基因,下游CaN/NFAT3信号通路受到抑制,从而减少COL-I的合成。3.在静压力的刺激下,CALR可能通过介导下游CaN/NFAT3信号通路影响COL-I合成,参与调控细胞外基质的纤维化过程。
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