扑草净（Prometryn）作为一种典型的三嗪类除草剂,因其杀草谱广、高效且药效持久等特点,在农业生产中被广泛应用。然而,农田中即便是微量的扑草净残留也会对后茬作物产生不同程度的药害,抑制作物生长,最终导致减产,严重时可造成绝收。因此,扑草净的过量施用会对农业生产产生一定的负面影响,其程度取决于后茬作物对扑草净的敏感程度。此外,农田土壤中残留的扑草净也会对生态系统和人类健康造成严重的威胁。这一系列由扑草净残留引起的问题己成为近年来的研究热点。生物强化是以微生物的生长代谢活动为核心的一项技术,该技术因其高效、无污染、低耗能等优点而逐渐成为治理环境污染的重要手段之一。目前已有部分研究报道了自然界中存在的能够降解扑草净的微生物,然而这些研究主要集中于降解菌株的筛选与降解途径的分析,关于微生物中与扑草净降解相关的功能基因仅有三嗪水解酶（TrzN）的编码基因被报道,可见对于该方面的研究仍存在一定局限性。此外,全基因组测序技术以及生物强化技术尚未被用于扑草净降解菌株的研究。因此,阐明扑草净的微生物代谢机制、鉴定降解过程中的中间产物、挖掘降解菌株基因组中的功能基因以及分析在生物强化过程中土著微生物群落结构的变化可为扑草净污染场地的生物修复提供理论支撑,同时也可为研究其它三嗪类除草剂降解机理提供参考依据,具有较大的理论意义和实际的应用价值。本研究以实验室前期分离的一株高效扑草净降解菌株Pseudomonas sp.DY-1为材料,利用单因素试验结合响应面法研究了菌株DY-1的最适降解条件,结果表明,菌株DY-1的最适降解条件为32.6℃,pH 7.9,接种量为5.8%。在该优化条件下,菌株DY-1在40 h内可将浓度为50 mg/L的扑草净降解完全。此外,对菌株DY-1降解特性的研究表明,该菌株不仅可耐受并降解浓度高达500 mg/L的扑草净,同时其在NaCl浓度为1000 mg/L的高盐浓度下仍然具备降解活性。在菌株DY-1以其它三嗪类除草剂为底物的降解谱实验中,观察到菌株DY-1对西草净（Simetryn）、敌草净（Desmetryn）、莠灭净（Ametryn）和嗪草酮（Metribuzin）均具有良好的降解效果。采用高效液相色谱与质谱联用技术（High-performance liquid chromatography/mass spectrometry,HPLC/MS）,对菌株DY-1降解扑草净过程中的中间产物进行鉴定。检测到3个保留时间分别为8.07 min、12.93 min和8.4 min,质荷比分别为258 m/z、274 m/z和212m/z的产物峰。根据扑草净的分子结构特征,结合各化合物的特征碎片离子峰,将这3个产物分别鉴定为扑草净的亚砜、砜和羟基衍生物,并由此推测了菌株DY-1降解扑草净的主要途径。在降解过程中,扑草净首先被氧化生成亚砜扑草净,再经由第二步氧化作用生成砜扑草净,最后水解生成终产物2-羟基扑草净。采用PacBio RS II测序平台对菌株DY-1的全基因组进行测序,将所得数据进行相应处理后对该菌株的全基因组序列进行了注释分析。菌株DY-1的基因组大小约为5.89 M,包含1个环状染色体和1个质粒。该基因组的总GC含量为62.94%,共含有5543个基因,平均长度为942 bp;含有71个tRNA,16个rRNA以及4个ncRNA。采用全基因组挖掘技术分析了菌株DY-1的应用潜力。结果表明,菌株DY-1的染色体中包含多种参与环境胁迫响应和有毒物质抗性等有利于菌株适应外界环境的基因,这些基因对细菌在恶劣环境中的生存起着至关重要的作用。以菌株DY-1全基因组注释信息为基础预测了可能的扑草净降解基因。该基因全长1530bp,编码509个氨基酸。经多序列比对,表明该基因的表达产物为一种Ⅰ型Baeyer–Villiger单加氧酶（Baeyer-Villiger monooxygenases,BVMO）,与结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）H37Rv中的乙硫异烟胺单加氧酶Eth A具有52.67%的同源性。以菌株DY-1基因组为模板,设计特异性引物扩增全长目的基因,构建表达载体并转化至Escherichia coli BL21（DE3）。重组菌经IPTG诱导和Ni-NTA柱纯化后,SDS-PAGE显示所得特异性条带大小约为60 k Da,与预计结果相符。使用纯化蛋白与300μM扑草净溶液配置反应体系进行反应,通过高效液相色谱（High performance liquid chromatography,HPLC）验证,结果显示反应进行1 h后该蛋白的扑草净降解率可达80%左右。借助λ-Red重组酶系统进行的基因敲除实验表明,敲除株在反应开始的10 h内几乎无法检测到降解活性,表明该基因在菌株DY-1降解扑草净的过程中发挥着重要的作用,该基因可被鉴定为新的扑草净氧化酶编码基因。将菌株DY-1投加到含有50 mg/kg扑草净的土壤中以构建扑草净污染土壤的生物强化系统,21 d后检测到土壤中扑草净的降解率为78.1%。该菌株应用特性的研究结果表明土壤中扑草净降解效果受土壤温度、土壤含水量和菌株接种量等因素的影响,菌株DY-1在温度为30℃,土壤含水量为20-30%,接种量为1×108 CFU/m L的条件下可达到其最佳降解效果。此外,外源营养物质的添加也能够促进土壤中扑草净的降解。使用菌株DY-1的培养液对受扑草净药害的玉米幼苗植株进行灌根试验,处理10 d后观察到玉米植株长势恢复至正常水平,表明该菌株对扑草净的药害具有明显的解除作用。利用Miseq高通量测序技术对生物强化系统中微生物群落结构进行动态监测,建立了微生物群落结构与功能的关系。结果表明,投加菌株DY-1促进了扑草净污染土壤中微生物群落的演替,投加菌株所属的假单胞菌属（Pseudomonas）成为体系中的优势种群,增加了土壤微生物对扑草净的耐受与降解能力。