华支睾吸虫病(clonorchiasis)又称肝吸虫病，是由华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)感染引起的一种人兽共患寄生虫病，其成虫寄生于人或其它保虫宿主的肝胆管内，虫体的机械刺激及分泌／排泄产物等可对肝胆系统造成慢性损伤，引起胆管局限性扩张、胆管上皮细胞增生、管壁增厚、管腔狭窄等病理改变，临床上可诱发胆管炎、胆囊炎、胆管肝炎、肝纤维化甚至肝胆管肿瘤。现全世界将近3500万人感染华支睾吸虫，主要流行于东亚和东南亚国家和地区，我国分布在除西北数个省区外的25个省，感染人数为1249万，以广东省感染最为严重，约500万。 目前，有关华支睾吸虫的生长发育、致病机制以及高效快速诊断方法的研究正在逐步进行，这些研究的全面开展对华支睾吸虫病的防治具有重大意义。 研究方法 1 CsCD-Asp基因的生物信息学分析华支睾吸虫成虫cDNA质粒文库进行表达序列标签(expression sequence tag，EST)随机测序和unigene归并、拼接，获得多个华支睾吸虫成虫全长基因。用BLASTx方法搜索GenBank中与之同源的蛋白序列，从中识别出CsCD-Asp基因。利用生物信息学软件Motifscan、Predictprotein、SignalP、Swiss-Model等对该基因进行结构和功能分析，预测CsCD-Asp蛋白的空间结构和功能。 2 CsCD-Asp基因的克隆、表达、纯化和免疫原性、免疫反应性分析 2.1 CsCD-Asp基因的扩增、克隆根据目的基因的ORF和原核表达质粒pET-28a(+)酶切位点，利用软件DNAClub和PCRdesign设计引物，PCR扩增CsCD-Asp基因，限制性内切酶Xho I、EcoR I双酶切空质粒pET-28a(+)和PCR产物，T4连接酶连接。用PCR、酶切及测序鉴定重组质粒。 2.2 CsCD-Asp基因的表达和纯化将pET-28a(+)-CsCD-Asp重组质粒转化大肠杆菌BL21／DE3中，在IPTG诱导下表达融合蛋白，并经SDS-PAGE鉴定，重组蛋白包涵体经SDS变性后用亲和层析纯化。 2.3 CsCD-Asp重组蛋白的免疫原性和免疫反应性分析 2.3.1免疫血清的制备用纯化的CsCD-Asp蛋白免疫SD大鼠，制备大鼠抗CsCD-Asp重组蛋白的免疫血清，并进行血清预吸附。 2.3.2感染华支睾吸虫大鼠血清的制备收集华支睾吸虫囊蚴，感染SD大鼠，每只经口灌胃感染约15-20个囊蚴。感染成功后每隔2-3周尾部取血，分离血清，-80℃保存备用。 2.3.3检测重组蛋白CsCD-Asp刺激SD大鼠产生抗体的趋势及其抗体类型采用ELISA方法，检测重组蛋白免疫SD大鼠，产生的特异性抗体的趋势及其抗体亚类。 2.3.4 CsCD-Asp的免疫原性和免疫反应性分析通过Western blotting方法，分别用上述制备的大鼠血清为一抗，分析纯化的重组蛋白的免疫原性和免疫反应性。 3 CsCD-Asp为华支睾吸虫成虫分泌／排泄抗原的鉴定、组织定位及其免疫学功能初步分析 3.1 CsCD-Asp为华支睾吸虫成虫分泌／排泄抗原的鉴定应用Western blotting方法，一抗分别用华支睾吸虫成虫免疫ESAs的大鼠血清、CsCD-Asp重组蛋白免疫的大鼠血清，以及免疫蛋白前的大鼠阴性血清对华支睾吸虫成虫的ESAs进行识别；同时用相同的抗体对CsCD-Asp重组蛋白进行识别。 3.2 CsCD-Asp组织定位及在尾蚴、囊蚴阶段的表达Trozol法提取总RNA，反转录成cDNA，用特异性引物，以cDNA为模板扩增目的基因，判断目的基因在尾蚴、囊蚴阶段的表达情况。 将华支睾吸虫成虫、尾蚴和囊蚴分别固定后用石蜡包埋切片，脱蜡水化并用组织淬灭剂处理后，一抗用纯化的免疫重组蛋白的大鼠血清，二抗用橙红色荧光Alexa Fluor(R)555羊抗大鼠IgG(H+L)，应用免疫荧光方法，在荧光显微镜下观察CsCD-Asp在华支睾吸虫成虫、尾蚴、囊蚴的组织定位。 3.3 CsCD-Asp的ELISA分析结果ELISA方法见第2章，随机选取38份不同感染度的华支睾吸虫病人血清，38份不同感染度的日本血吸虫病人血清，38份健康人血清，比较重组蛋白与成虫粗抗原诊断的敏感性以及是否与日本血吸虫病人的血清发生交叉反应。 研究结果 1 CsCD-Asp基因的生物信息学分析CsCD-Asp基因具有完整的开放阅读框，其ORF从第29个bp到1，306个bp，起始密码为ATG，终止密码为TGA，编码425个氨基酸，理论分子量为46.5kDa，SignalP分析结果显示该蛋白含有信号肽，切割位点在第17aa-18aa位氨基酸之间。PredictProtein预测该序列二级结构中a螺旋(H)、β折叠(E)和无规则卷曲(L)的比例分别是8.47％，40.47％，51.06％。Motifscan预测该蛋白具有两个天冬氨酸蛋白酶的催化位点，分别为84aa-85aa和270aa-281aa。InterProScan显示该蛋白具有组织蛋白酶D的结构域，是属于天冬氨酸蛋白酶家族的组织蛋白酶D。Swiss-Model软件分析发现该蛋白的两个天冬氨酸蛋白酶的催化位点在空间上形成对称结构。 2 CsCD-Asp基因的克隆、表达、纯化和免疫原性、免疫反应性分析设计引物从质粒cDNA文库中扩增CsCD-Asp目的片段，用琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA条带在10,00bp与20,00bp之间，定向克隆获得的重组原核表达质粒pET-28a(+)-CsCD-Asp经PCR、双酶切和测序鉴定后证实构建成功。重组质粒在IPTG诱导下表达重组蛋白，经SDS-PAGE显示与理论预测的融合蛋白分子量相符，表达产物经变性、亲和层析纯化，获得目的蛋白。 ELISA检测抗体变化趋势的结果，表明该蛋白能够刺激SD大鼠产生特异性抗体，具有免疫原性。抗体亚类的检测结果为IgG2高于IgG1，提示该蛋白主要刺激大鼠产生细胞免疫应答。 Western Blotting方法鉴定该蛋白的免疫原性和免疫反应性结果表明，重组蛋白可分别被免疫重组蛋白的大鼠血清、感染华支睾吸虫的大鼠血清识别，表明重组蛋白能够刺激大鼠免疫系统产生相应的特异性抗体，具有免疫原性，并且具有免疫反应性，说明该蛋白具有免疫学研究价值。 3 CsCD-Asp华支睾吸虫成虫分泌／排泄抗原的鉴定、虫体定位和其免疫学功能初步研究Western blotting结果表明免疫CsCD-Asp重组蛋白的大鼠血清可以识别ESAs中的一条天然蛋白条带，而免疫华支睾吸虫ESAs的大鼠血清亦可识别重组蛋白，故认为CsCD-Asp是华支睾吸虫的ESAs组分之一。成虫虫体免疫组织化学定位实验结果表明，该蛋白定位于虫体的肠支，进一步表明CsCD-Asp是华支睾吸虫的ESA。RT-PCR和免疫组织化学检测结果均表明此蛋白在尾蚴和成虫阶段表达，而在囊蚴阶段不表达，表明该蛋白在虫体发育过程中存在阶段性表达，提示该蛋白可能与入侵宿主有关。 应用ELISA方法，分别以CsCD-Asp重组蛋白和成虫粗抗原为检测抗原，检测38份华支睾吸虫病人和38份日本血吸虫病人血清的总IgG，结果表明，重组蛋白和粗抗原诊断的敏感性分别为21％和84.2％，重组抗原诊断的敏感性比粗抗原低；与日本血吸虫病人血清均存在交叉反应。 研究结论 1、从华支睾吸虫成虫的cDNA文库中识别出CsCD-Asp基因，CsCD-Asp全长1，459个核苷酸，编码425个氨基酸，含有天冬氨酸蛋白酶的激活位点。 2、成功构建了pET-28a-CsCD-Asp原核表达载体，细菌培养物经过IPTG诱导表达出重组融合蛋白，纯化得到重组蛋白。ELISA结果显示CsCD-Asp重组蛋白能够刺激大鼠产生特异性抗体，并且诱导大鼠产生以IgG2为主的细胞免疫应答。Western Blotting结果表明该重组蛋白具有较强的免疫原性和免疫反应性。 3、CsCD-Asp定位于虫体的肠支，免疫印迹分析发现该蛋白为华支睾吸虫成虫的分泌／排泄抗原中主要蛋白成分之一。 4、RT-PCR和免疫组织化学结果显示：该基因可能是阶段性表达的，成虫和尾蚴时期有表达，但在囊蚴时期不表达。 5、应用ELISA方法，比较重组抗原和成虫粗抗原检测华支睾吸虫病人血清IgG敏感性表明，该重组蛋白诊断的敏感性低于粗抗原；与日本血吸虫病人血清存在交叉反应。