硫是生命活动的必需元素，主要以-2和+6价发挥生物学功能。硫的活化是硫同化代谢的关键反应，包括ATP硫酸化酶（ATP sulfurylase，ATPS）催化硫酸盐与ATP反应生成腺苷-5-磷酰硫酸（adenosine5-phosphosulfate，APS）和焦磷酸(pyrophosphate，PPi)以及腺苷-5-磷酰硫酸激酶(adenosine5-phosphosulfate kinase，APSK)催化APS的3羟基磷酸化生成3-磷酸腺苷5-磷酰硫酸(adenosine3-phosphate5-phosphosulfate，PAPS)两步反应。PAPS作为胞内硫酸化反应的硫供体以及PAPS还原酶的底物，可生成3，5二磷酸腺苷(3，5bisphosphate adenosine，PAP)。酵母3，5二核苷酸酶(Yeast3，5-Bisphosphate Nucleotidase，YND)，亦称为HAL2，催化PAPS或者PAP脱磷酸生成APS或AMP，参与细胞硫代谢和抗盐性。YND和PAP之间具较高的亲和力，其KmPAP为亚微摩尔。此高亲和力及PAP琼脂糖的存在使得YND作为亲和标签纯化蛋白成为可能。亲和层析是最常见的蛋白纯化方法之一，不同的纯化标签都有自己的优缺点，开发新的标签以及组合使用不同标签可不断开发新的亲和层析工艺。为探索YND作为一个蛋白纯化亲和标签的可行性，我们对YND的特性进行了深入分析。结果表明KmPAP和kcatPAP分别为0.3μM和11 s-1，在Ca2+或Mg2+存在的情况下其Kd分别为0.008和0.49μM。pH影响YND对PAP的亲和力，pH7.5和pH8时，其亲和力最强Kd为～8 nM。通过构建一系列表达YND，YND-APSK，YND-蛋白酶载体，基于Ca2+可有效促进YND·PAP的形成，抑制YND对PAP的水解，且易于被EGTA螯合进行洗脱等，我们合理设计了YND融合蛋白的纯化步骤，并成功纯化、分析大肠杆菌APSK。通过比较不同标签的经济性、促溶、流速、产品纯度和产量等特性，我们发现YND是有效、经济的原核蛋白表达、纯化标签。　　YND活性的改变可调节胞内PAP的浓度，从而影响磺基转移酶，酰基载体蛋白合酶和RNA加工酶的活性，进而影响细胞的生长发育。PAPS是胞内硫酸转移酶的底物，YND如何区分PAPS和PAP尚无相关报道。通过分析其晶体结构，发现G236的R基团，可能对于PAPS或者PAP的结合具有一定的影响。将G236突变为较大R基团氨基酸，对其相应蛋白进行活性分析发现随着R基团的增大，对PAPS的亲和力降低。G236V水解PAP的催化效率为水解PAPS的5592倍，使得G236V成为PAP特异性3磷酸核苷酸酶。通过和肌激酶、丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶偶联，G236V可作为偶联酶分析硫酸转移酶的酶学特性。　　APSK催化APS磷酸化的机理已经较为清楚，但作为APS类似物的AMP是否可以作为APSK的底物，尚无相关报道。通过对APSK的三维结构进行分析发现，R68同时和APS的α磷酸根和β硫酸根形成氢键，稳定APS的结合。而K侧链基团比R短2.4(A)，R68K突变将导致K不能和距离较远的β硫酸根离子相互作用，从而减弱APS的亲和力，而增加与α磷酸根离子的相互作用，可能提高AMP的亲和力。我们的研究结果表明AMP可作为APSK的底物，反应生成PAP。R68K突变体的最适底物变为AMP，KmAMP降低为对照的0.2倍，而催化效率提高5倍。此结果为进一步构建AMP3羟基激酶提供了基础。　　本文构建了一种基于YND的亲和层析体系，一种可用来测定硫酸转移酶活性的PAP特异3核苷酸酶和可磷酸化AMP形成PAP的3羟基激酶。