研究背景及目的:胆囊癌(gallbladder carcinoma,GBC)是胆道系统中一种发病率较高的恶性肿瘤,在胆道系统恶性肿瘤中占于首位,在消化系统恶性肿瘤中占第五位。但随着流行病学调查、研究的不断深入,近年来发病率亦出现了逐年上升的趋势。胆囊癌发病初期较隐匿,潜伏期长,早期诊断困难,往往发生在胆囊结石合并胆囊炎而行胆囊切除术时发现的“意外胆囊癌”,而无明显的临床表现。再加上手术方式尚不固定,很多意外胆囊癌行经腹腔镜胆囊切除术而导致早期腹腔内广泛转移亦不为少数。而且,对不能手术者或术后复发或转移者,药物化学性治疗以及放射治疗,效果均不十分理想。因此,此种疾病越来越得到大家的重视,胆囊结石,胆囊炎至胆囊癌的“炎癌转变”亦受到大家关注。对于胆囊癌发病的具体分子机制尚不特别明确,以及耐药性强的特点,多种基因、信号转导通路的研究都在广泛的进行中,如Nakamura报道的EGFR、ERBB3和PTEN在胆囊癌中的发生了突变,以及针对HER2、VEGF、PI3k/PTEN、AKT/mTOR、FGFR、IDH、MEK/ERK和多激酶途径的药物或抑制剂的实验的实施。但是,目前仍无关于胆囊癌的发生发展的具体分子机制及靶向治疗的报道。同源性磷酸酶-张力蛋白(phosphatase and tensin homolog,PTEN)是一种十分重要的癌症监护基因,亦被认为是仅次于P53的第二大的肿瘤抑制性基因。PTEN编码的蛋白质能够抑制PI3K/Akt、MAPK、FRAP/mTOR、NF-κB等信号传导通路,参与调节细胞生长、代谢、维持内环境稳态等多种生命活动,其功能和表达的异常与人类多种恶性肿瘤的发生、发展有密切相关性。PTEN可以通过干扰细胞周期、诱导细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成、阻碍肿瘤的侵袭和转移、维持免疫稳态等一系列进程,完成其强大的抑癌作用。在胆囊癌中,PTEN在其发生、发展等系列过程中也起着十分重要的作用。PTEN的缺失与胆囊癌,特别是胆囊腺癌的临床、病理、预后之间的关系密切相关,但分子机制尚不明确。此文中,我们进一步探究PTEN在胆囊癌发生发展中的作用以及发挥功能的具体分子机制,为胆囊癌的临床分子的靶向治疗策略提供潜在的干预靶点和新的思路。研究方法:1.本研究获取了2010年1月到2016年12月海军军医大学附属东方肝胆外科医院收治的胆囊癌患者,收集了经过根治性治疗并经术后病理诊断为胆囊癌的患者的临床病理资料。共350例患者纳入了此项研究。所有患者均常规接受了术前的系列相关检查,均予以行胆囊根治性切除性手术。临床胆囊癌TNM(Tumor node metastasis,TNM)分期(2017)均根据AJCC(American Joint Committee on Cancer)(美国癌症联合委员会)(第八版)标准。该组患者均根据标准随访流程进行随访。总体生存时间是本次研究的终点。分类变量用例数(百分数)表示,组间比较应用χ2检验,Yates’校正检验或者Fisher’s精确检验。连续型变量用中位值(四分位数)进行表示,组间差异性比较,我们应用t检验或者Mann-Whitney U检验。采用Kaplan-Meier法,我们来估计,这组患者术后的总体生存率。采用Log-Rank检验的方法,比较生存分布之间差异。采用COX等比例风险回归模型,我们探索了影响了胆囊癌患者的术后复发以及总体生存率的独立的危险因素。利用SPSS 19.0和R软件2.10.1(R Foundation for Statistical Computing,Vienna,Austria;www.r-project.org)进行数据分析。2.对本院收集的正常胆囊及胆囊癌组织提取的mRNA进行实时定量RT-PCR检测,检测PTEN在转录层面的表达水平。同时,抽取样品蛋白进行蛋白质印迹分析。随后对这些样品进行石蜡包埋,后用免疫组织化学的方法检测了PTEN蛋白的表达。3.对东方肝胆外科医院张永杰教授手术组2014.1-2016.12行胆囊癌根治手术的患者的胆囊癌组织,共计157例蜡块病理组织标本,进行免疫组织化学染色分析PTEN表达情况。用K-M方法,我们在检测样本中比较高、低表达PTEN的患者预后情况。4.对胆囊癌细胞系GBC-SD、EHGB1、NOZ、NZ细胞,提取蛋白,采用Western Blotting方法检测PTEN、p-AKT、AKT和β-actin蛋白水平。设计针对PTEN基因的外显子的引物对四种细胞系进行PCR检测。并设计靶向PTEN探针,进行深度靶向测序分析。5.构建PTEN稳定干扰的细胞系,进行PCR检测,Western Blotting方法检测在此细胞系中,PTEN的mRNA水平和蛋白水平。用此细胞系进行平板克隆形成实验,同时CCK-8实验法,来检测细胞增殖的情况。6.对低表达PTEN和对照组细胞进行软琼脂克隆形成实验来探讨高低表达PTEN对胆囊癌细胞恶性生长的影响。随后,用Matrigel-coated Boyden chamber检测PTEN对胆囊癌细胞转移和侵袭能力的影响。7.应用Western Blotting实验检测了的PARP、P53和γH2AX的蛋白水平,这些蛋白反应了DNA损伤程度。应用定量PCR和Western Blotting的方法检测差异表达PTEN的癌细胞中是否存在EMT表型的转变。8.选取多种通路的抑制剂和常用肿瘤化疗药物,用CCK-8试验的方法对胆囊癌进行药物筛选试验。9.用稳定干扰PTEN的NOZ、GBC-SD细胞系,使用吉西他滨(GEM)、5-Fu、EPB和Bortezomib分别处理干扰组和对照组,仍然使用CCK-8试验。随后对处理过的细胞进行Caspase3/7活性检测。紧接着用光镜观察干扰PTEN的胆囊癌细胞死亡情况。对经过药物处理的对照和干扰细胞进行PI染色,经荧光显微镜下计数检测证实光镜下所见。对Bortezomib和GEM处理发生凋亡细胞进行流式检测。10.对体外培养NOZ对照和干扰PTEN的NOZ细胞系进行裸鼠皮下荷瘤试验。11.PDX模型的建立。建模成功后,免疫组化CK19确认,同时进行PTEN蛋白染色,分为阳性和阴性/低表达组。再次将成功荷瘤组织体外扩增,并进行药敏试验。12.用腺病毒在GBC-SD细胞中过表达PTEN与干扰掉PTEN的细胞同时进行定量PCR检测PTEN的表达与蛋白酶体的糜蛋白酶、胰蛋白酶和Caspase样的活性之间的关系。应用Western Blotting方法分析了干扰PTEN和过表达PTEN细胞中PSMB1、PSMB5、PSMD10、PSMD11的蛋白水平。研究结果:1.本研究纳入病人350例,单因素分析显示,黄疸,肿瘤位于肝脏侧,淋巴结N2、N1转移,非根治性切除,肿瘤差分化,以及TNM分期III&IV期为患者术后总生存的影响因素。多因素分析发现肿瘤位于肝脏侧,淋巴结N2、N1转移,非根治性切除以及TNM分期III&IV期是患者术后总体生存的独立危险因素。2.胆囊癌组织中PTEN在转录层面的表达低于正常胆囊组织。对收集的冰冻的胆囊癌和胆囊组织样品进行分析,PTEN在6例肿瘤组织中5例呈低蛋白表达,4例胆囊癌组织中p-AKT呈现较高表达水平。对这两组石蜡包埋后检测PTEN,PTEN在正常胆囊组织中为高水平的表达,而在胆囊癌组织中约50%呈现低水平表达。3.在157例张永杰教授组实施手术时获取的胆囊癌组织中,根据免疫组化PTEN蛋白表达强度分为2组,PTEN蛋白高有67例,PTEN蛋白低表达有90例。与高表达PTEN组患者相比,低表达PTEN组患者总的生存时间更短,预后更差(p=0.006)。且PTEN低表达是术后总体生存的独立危险因素。4.四种胆囊癌细胞系检测PTEN、p-AKT、AKT和β-actin蛋白水平,显示GBC-SD细胞中PTEN为低水平表达,而另外三种相反,呈较高水平。提示PTEN的低表达促进了下游信号通路的活化。检测了PTEN基因的9号外显子拷贝数,GBC-SD细胞9号外显子为单拷贝,其余3株细胞为双拷贝。设计的靶向PTEN的探针,进行了深度靶向测序分析,GBC-SD细胞PTEN为杂合性丢失,其余细胞为双拷贝,并且这四株细胞均没有检测到PTEN发生突变。5.建立稳定干扰PTEN细胞系,行细胞克隆形成及CCK-8细胞增殖试验,结果提示PTEN的干扰与否对正常培养的胆囊癌细胞增殖可能影响不大。采用软琼脂克隆形成实验,干扰PTEN非常显著的抑制了肿瘤细胞的恶性增殖,同时受抑制的还有胆囊癌细胞迁移及侵袭能力。6.测定DNA损伤的相关蛋白的水平,提示PTEN的干扰引起了基因组DNA的损伤,引发的基因组的不稳定性。PTEN对胆囊癌间质样表型有维持作用。7.相比野生型NOZ,PTEN单拷贝的GBC-SD胆囊癌细胞对多种药物显示较高的敏感性。8.干扰PTEN的表达增强了NOZ-shPTEN对GEM的药物敏感性,EPB反而对药物产生抵抗,对Bortezomib表现出高度药物敏感性。Bortezomib处理使得更多PTEN敲低细胞发生凋亡。光镜观察和PI染色,处理后的细胞剪切的PARP及Caspase3水平,以及发生凋亡的细胞进行流式检测也证实这一点。9.稳定干扰PTEN的GBC-SD细胞系,干扰PTEN进一步增强了GBC-SD细胞对Bortezomib的药物敏感性。Bortezomib处理使得更多PTEN敲低的GBC-SD细胞发生凋亡。10.体外培养的NOZ对照和干扰PTEN细胞系,进行裸鼠皮下荷瘤试验以及药敏试验,shPTEN+BZ组肿瘤最小。shPTEN组的肿瘤组织内Bortezomib处理组Ki67蛋白水平显著低于对照组和生理盐水处理组染色,Bortezomib处理shPTEN组Caspase3上调最为显著。11.PDX小鼠体内肿瘤按PTEN高低表达分组,分别给药,结果证实单独Bortezomib给药对PTEN阴性PDX肿瘤细胞有好的治疗效果。12.将过表达的和干扰过PTEN的GBC-SD细胞行RT-PCR,PTEN的表达显著抑制了蛋白酶体的活性,干扰PTEN的细胞内蛋白酶体的活性则显著上调。干扰PTEN显著提高蛋白酶体各组分的蛋白水平,而过表达PTEN则可以显著降低它们的蛋白水平。研究结论:根据以上实验结果我们可以清楚地发现,PTEN在胆囊癌病人肿瘤组织中,存在较高比例的缺失或低表达,而在正常胆囊中则正常阳性表达。PTEN缺失或低表达的患者总生存时间短,恶性程度高。在胆囊癌细胞系中,我们发现,PTEN对肿瘤细胞的基因组稳定性和DNA的损伤修复具有调节作用,而PTEN的缺失则会影响基因组的稳定性和DNA的损伤,而导致较差的预后。我们选取了多种信号通路的抑制剂和临床常用的肿瘤化疗药物进行针对胆囊癌治疗的药物筛选实验。不管是PTEN缺失的肿瘤细胞,还是在裸鼠体内细胞荷瘤实验,或是PDX小鼠体内行荷瘤实验,均提示,在PTEN阴性组单独BTZ给药即可达到很好的治疗效果。最后,我们进一步在细胞系中证实,PTEN的缺失或低表达上调了蛋白酶体组分的表达和蛋白酶活性,使得肿瘤细胞对高蛋白酶体活性产生高度依赖性。