排卵是雌性哺乳动物中非常重要的生理活动,而这一过程受到许多因素的协同调控,其中,由于激素调节广泛性和容易引起级联反应的特点被认为是排卵期主要的调控因素之一。排卵的正常发生除了要受到促卵泡激素,黄体化激素的调节,还会受到雌激素和孕酮的调节。哺乳动物体内雌激素和孕酮发挥生理作用几乎都要与其特异性受体结合才能实现。在对孕酮受体敲除型小鼠的各项研究中发现,当孕酮受体表达异常时,可直接影响雌性哺乳动物的诸多生殖功能的正常进行,特别是在排卵这一生理过程中,孕酮受体的正常表达变得十分重要。近年来,通过RNA-Seq和CHIP-Seq实验已经筛选出了大量孕酮受体的下游基因,其中,过氧化物酶体增生激活受体γ和基质金属蛋白酶1被认为是孕酮受体在卵巢中介导排卵过程的关键信号分子。此外,排卵过程中,雌激素和孕酮的血液内含量呈现一定的相关性,是否彼此调控对方的分泌尚未清楚。同时,雌激素能够影响细胞内孕酮受体的表达已得到证实,但具体的分子机制还有待研究。随着雌性生殖研究的深入,大量研究结果发现,雌激素含量变化会导致部分miRNA出现差异性表达。此外,也有实验证实mi RNA是调控孕酮受体表达的诸多要素之一。miR-26a/b是一类常见的哺乳动物miRNA,测序数据显示在卵泡发育期间的颗粒细胞中,miR-26a/b维持高水平表达且在卵泡发育不同时期存在表达差异,这一现象说明miR-26a/b可能作为一种重要的调节因子参与排卵过程。本实验拟探究在排卵过程的正常进行,是否要依赖于颗粒细胞中miR-26a/b介导雌激素对孕酮受体的调控作用。研究结果显示,在小鼠原代颗粒细胞中,经雌激素处理24h后,通过RT-PCR检测pri-miR-26a/b,pre-miR-26a/b,mi R-26a/b的表达量都显著下调(p≤0.05),此外,通过RT-PCR和Western Blot检测发现孕酮受体及其下游基因过氧化物酶体增生激活受体γ和基质金属蛋白酶1的mRNA和蛋白表达均发生显著上调。通过生物信息学分析miRNA调控孕酮受体3’-UTR序列的靶位点序列,构建双荧光报告载体以及位点突变载体。荧光数据显示,miR-26a/b可特异性结合到孕酮受体3’-UTR序列,并引起蛋白水平的下调。为了进一步证实miR-26a/b可介导雌激素对孕酮受体表达的调控,实验选取了人颗粒细胞系(KGN)作为实验对象。KGN细胞在经雌激素处理24h之后,细胞内pri-miR-26a/b,premiR-26a/b,miR-26a/b的表达量都显著下调(p≤0.05),此外,孕酮受体及其下游基因过氧化物酶体增生激活受体γ和基质金属蛋白酶1的mRNA和蛋白表达均发生显著上调,结果与小鼠原代颗粒细胞处理组一致。通过采用雌激素受体拮抗剂,它莫西芬和雌激素受体干扰RNA,shER阻断雌激素信号通路,结果显示,细胞内pri-miR-26a/b,pre-miR-26a/b,miR-26a/b的表达量都显著上调(p≤0.05),同时孕酮受体及下游基因在mRNA和蛋白水平显著下调。为了进一步证实miR-26a/b对于下游基因的调控,实验中采用miR-26a/b minics和miR-26a/b inhibitors分别处理KGN细胞,结果显示,miRNA minics处理后,孕酮受体及下游基因的表达受到阻遏;当用miRNA inhibitors处理细胞后,孕酮受体及下游基因的表达发生显著性上调趋势。为更加精确模拟miRNA在细胞内的成熟过程,实验通过构建pre-miR-26a/b表达载体以实现miRNA在细胞中长期稳定表达。瞬时转染miRNA表达载体,可抑制雌激素对孕酮受体的调控。综上,研究结果显示,在雌性哺乳动物颗粒细胞中,孕酮受体响应雌激素信号分子有可能是由miR-26a/b介导来实现的,这说明孕酮受体调控雌性哺乳动物排卵时并不单纯依靠孕酮的调控。这为进一步探索激素协同调控雌性哺乳动物排卵过程提供新的视角。