近年来，恶性肿瘤已成为威胁人类生命的顽疾之一。治疗肿瘤的方法主要有手术切除、化学疗法、放射疗法、超声热疗、光动力学疗法、肿瘤免疫疗法等，但各种方法均不能单独成为一种根治肿瘤的手段，综合治疗已逐渐成为治疗肿瘤的趋势。光动力学疗法(PDT)于1978年由美国学者Doughtery等首先提出，并已应用于临床诊治肿瘤。但由于光的穿透能力差，该法主要应用于人体表面及浅层肿瘤的治疗，而对深部和中晚期肿瘤的治疗具有一定的困难。1989年，日本学者在光动力学疗法的基础上提出了一种新的抗肿瘤理论一声动力学疗法(Sonodynamic Therapy，SDT)。该理论主要是利用超声能穿透深层组织并聚焦于特定的部位，激活富集在此部位的光敏剂产生协同效应从而起到抗癌效果。该法弥补了光动力学疗法只能治疗机体浅表肿瘤的局限性，具有更为广阔的研究价值和临床应用前景。SDT作为一种具有重要理论研究意义和临床应用价值的抗肿瘤新思路，倍受国内外学者关注。随着对声动力疗法研究的不断深入，科学家提出了很多理化机制，但对肿瘤细胞作用的生物学机制仍在探索中。本实验室有研究表明，血卟啉可明显增强超声对H22腹水肿瘤细胞的杀伤程度，并且可对H22细胞造成继发性损伤，其作用的敏感位点主要是细胞的膜性结构，其中线粒体是易受损的膜性细胞器之一。最近本实验有研究成果表明超声激活原卟啉对S180肿瘤细胞有协同杀伤作用。但是超声结合原卟啉对H22肿瘤细胞的损伤之前尚未有研究。本论文在前期实验基础上，以国家自然科学基金项目“超声激活血卟啉诱导肿瘤细胞凋亡的分子生物学机制”为依托，采用频率1.80MHz，声强1.0W／cm~2的聚焦超声和浓度为0.02mg／ml的原卟啉为实验参数，利用台盼蓝染色，电子显微镜观察，紫外分光光度法，细胞荧光染色，免疫细胞化学等方法，对H22细胞从细胞形态变化，线粒体通透性转换，线粒体跨膜电位改变，凋亡相关蛋白表达变化，及细胞内活性氧的积累等方面进行实验研究，所得实验结果如下：1．采用1.0W／cm~2的超声强度，检测不同超声(结合原卟啉)照射时间对H22细胞的杀伤作用，发现声照时间不同，细胞相对存活率也不同。随着超声照射时间的增加，超声组和超声结合原卟啉组H22细胞相对存活率均有所下降；而且在同一声照时间下，超声与原卟啉的协同作用使H22细胞相对存活率更低。根据实验所得数据确定声照时间为30s。2．超声强度为1.0W／cm~2，声照时间30s处理肿瘤细胞。分别于声照后0、1、2、3、4、5h取材，检测超声结合原卟啉对H22细胞的杀伤作用。发现与对照组比较，原卟啉组的H22细胞相对存活率随时间变化不大，超声组和超声结合原卟啉组的H22细胞相对存活率随着时间的延长而降低。而且在同一时间段取材时，超声结合原卟啉对H22细胞的损伤更严重，同时确定实验的取材时间为超声处理后0—5小时。3．扫描电镜观察发现单纯超声对H22肿瘤细胞表面结构有一定影响，同等强度超声结合原卟啉对肿瘤细胞的损伤更大，超声组较超声结合原卟啉组的继发损伤效应要弱；透射电镜观察发现单纯超声及超声结合原卟啉对肿瘤细胞线粒体、内质网、核膜、染色质及胞质密度均有不同程度的损伤，且随着处理后取材时间的延迟这种损伤效应逐渐加剧。并且在超声结合原卟啉组处理后3h取材发现，核膜破裂，核物质凝集等细胞凋亡的形态特征。4．线粒体膜通透性转运孔(PTP)在细胞凋亡过程中通透性会发生改变，被称为膜通透性转化(PT)。用紫外分光光度法检测PTP的开放程度，发现超声结合原卟啉能够诱导膜通透性转化，线粒体膨胀从而导致肿瘤细胞死亡或凋亡。且这种转化随取材时间的延迟不可逆。5．线粒体膜通透性转化可以引起线粒体跨膜电位下降。正常生理状态下肿瘤细胞具有内负外正的跨膜电位，能够摄入线粒体外的阳离子染料，当这种内负外正的跨膜电位消散时阳离子染料不被摄入。利用阳离子荧光染料罗丹明123标记线粒体，激光共聚焦扫描显微镜检测声动力学疗法对肿瘤细胞线粒体跨膜电位的影响，实验结果表明超声激活原卟啉能够导致肿瘤细胞线粒体跨膜电位下降。6．免疫细胞化学方法检测与凋亡相关的Bax、Smac、细胞色素C和caspase-3四种蛋白的动态表达。实验结果发现，不同的取材时间里，对照组和原卟啉组的四种蛋白表达变化不明显，超声组和超声结合原卟啉组的四种凋亡相关蛋白表达随取材时间延迟逐渐增强，且同一取材时间超声结合原卟啉组较超声组蛋白表达量高，二者均显示出继发效应。7．细胞内的活性氧过度积累引起细胞内一系列氧化还原反应是凋亡细胞的一个重要特征。线粒体不仅是活性氧的重要产生部位且是活性氧作用的敏感位点之一。用激光共聚焦扫描显微镜观察肿瘤细胞内活性氧的生成情况发现，超声结合原卟啉能够改变肿瘤细胞内活性氧的水平，且超声结合原卟啉组从即时取材到处理后60min活性氧水平不断升高，较单纯超声组活性氧水平上升快。超声组处理后90min取材活性氧水平开始下降。