论文部分内容阅读
目的： 人类颅内囊性动脉瘤是严重威胁生命的一种疾病，动脉瘤的发生率在人类为6％。关于动脉瘤的成因有许多假说，如细胞凋亡假说、炎性细胞浸润假说等，但没有一个很有说服力的理论形成。所有假说皆认为正常动脉壁的损伤是动脉瘤形成的病理学基础。NOS分为神经元型NOS(nNOS)、诱发型NOS(iNOS)和内皮型NOS(eNOS)3种类型。nNOS和eNOS统称为结构型，主要调节生理功能;iNOS主要在病理情况下产生，在疾病的发生发展过程中起重要作用。一氧化氮(NO)可以参与循环系统以及神经系统的大量病生理过程，NO具有双重作用，如作为第二信使可以引起血管扩张作用，如达到一定浓度可造成细胞的氧化应激损伤细胞。动脉瘤病理显示诱导型一氧化氮合酶(iNOS)诱导的NO能够促进动脉瘤形成还可能通过内皮损伤使血管壁的完整性受到破坏从而导致动脉瘤的发生。如果能够在人类颅内动脉瘤标本中发现一氧化氮合成酶ONOS)的升高则可以证实NO对动脉瘤形成的作用。本文通过研究一氧化氮合成酶(iNOS)在颅内动脉瘤中的表达，探讨了NOS对动脉瘤发生、发展及破裂的影响。 方法： 一、RT-PCR检测颅内动脉瘤中iNOS的mRNA水平 取出颅内动脉瘤组织及颞叶皮层动脉血管组织（对照组）100mg，以美国Promega总RNA提取试剂盒提取组织总RNA，总RNA提取后以紫外分光光度计计算总RNA含量。取4μg总RNA，试剂盒说明进行反转录。取2μl反转录反应液，进行PCR扩增。PCR反应的变性、退火和延伸温度分别为:93℃、58℃和72℃，反应时间分别为45s、45s和1min。共进行32个循环。反应完成后，取PCR产物NOS7.5μl+β-actin7.5μl的cDNA，行15g/L琼脂糖电泳，凝胶以美国GDs7600凝胶扫描分析系统行吸光度扫描，计算出NOS基因表达量与其相对β-actin表达量的比值。 二、Western印迹检测iNOS在颅内动脉瘤中的表达 取下组织样本后匀浆制成20％的组织匀浆。测定蛋白浓度后，按每个样本加20ug总蛋白，于不连续的聚丙烯酰胺凝胶中进行蛋白电泳（200 V,电泳1小时），其溶解胶和积层胶聚丙烯酰胺浓度分别为7.5％和5.0％。电泳完毕后将凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜（100 V,转移1小时）。转膜后以5％脱脂牛奶（溶于Tris缓冲液）封闭其非特异性结合位点，继之将膜置于含有小鼠抗iNOS抗体(1∶2000)的Tris缓冲液中，孵育过夜(4℃)，洗膜后，将膜与羊抗小鼠IgG(1∶1000)抗体孵育，其中羊抗小鼠IgG抗体分子上连接有辣根过氧化物酶，孵育2小时后，以化学荧光发光剂检测结合抗体的密度并进行显影。 三、NOS活性的测定 颅动脉瘤组和对照组的组织标本均采用生理盐水匀浆、离心(3000 r/min，10min)制备组织蛋白提取液。离心后的组织蛋白提取液分装。对组织蛋白提取液采用Bradford法测蛋白含量。采用试剂盒（南京建成生物工程研究所）分别测量组织标本总一氧化氮合酶(total NOS，T-NOS)和诱导型一氧化氮合酶(inducibleNOS，i-NOS)的活性。 四、血清NO检测 取对照组和颅动脉瘤患者髂外动脉血2ml置于促凝试管，1h后3000 r/min离心，取上清液-20℃冻存待测。NO检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，硝酸还原酶法测定血清中亚硝酸盐/硝酸盐(NO2/NO3)含量以代表NO浓度。所有操作按试剂盒说明书严格进行。 五、统计学方法 采用SPSS10.0统计软件进行统计分析，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。 结果： 一、颅动脉瘤中iNOS的mRNA表达 RT-PCR结果显示，在对照组及颅动脉瘤组织中均有iNOS mRNA表达，但是在正常组织中iNOS mRNA的表达量较少而在颅动脉瘤组织中NOS mRNA表达明显多于对照组。 二、Western-blot结果 为了进一步检测NOS在颅动脉瘤中的表达情况，我们使用特异的iNOS抗体进行蛋白表达的检测。免疫印迹结果显示，在正常对照组织中NOS表达量很低而在颅动脉瘤中NOS表达较对照组出现明显增加现象。结果显示蛋白表达同mRNA表达趋势相一致。差异有统计学意义(P＜0.01)。 三、T-NOS和i-NOS的活性 动脉瘤标本中i-NOS与T-NOS活性之比为(33.18±4.89)％;正常血管标本中i-NOS与T-NOS活性之比为(16.28±4.98)％。两者相比，相差非常显著(P＜0.01)四、血清NO检测 颅动脉瘤患者血清NO含量较对照组明显升高（P＜0.05，表1）。差异有统计学意义（P＜0.05，表1）。 结论： 本文通过研究一氧化氮合成酶(iNOS)在颅内动脉瘤中的表达，探讨了iNOS对动脉瘤发生、发展及破裂的影响。实验中采用PCR及Wester-blot方法检测脑动脉瘤标本中一氧化氮合酶(iNOS)的表达。同时检测了动脉瘤标本和正常血管标本中iNOS活性改变情况。并检测了血清中NO的改变。结果显示iNOS在动脉瘤中的mRNA及蛋白表达明显增高。动脉瘤标本中i-NOS与T-NOS活性之比高于正常血管标本中i-NOS与T-NOS活性之比，差异具有统计学意义。因而我们认为iNOS在动脉瘤壁中的含量升高可能造成NO的积聚从而损伤动脉壁引起颅内动脉瘤的发生。