香雪兰(Fressia hybrida),鸢尾科香雪兰属多年生球根草本花卉,原产非洲南部好望角,现广为栽培,是世界十大名贵切花之一,主要用于盆栽和切花生产。目前,香雪兰约有500种园艺品种,在生产上常根据花色分为红色系、黄色系、白色系、蓝色系等栽培品系,由于香雪兰花色艳丽且丰富,是进行植物花色研究的理想材料。在植物花色形成过程中,UDP-葡萄糖:类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶(UF3GT)通常作用于花色苷合成途径的最后一步,其能够催化UDP-葡萄糖中的糖分子转移到花色素的3’羟基位点上,将花色素转化生成稳定的花色苷,该催化步骤对花色素的稳定性及其在液泡中的溶解性至关重要。本论文以香雪兰UF3GT作为研究对象,进行基因克隆,并对该基因的功能进行研究,初步探讨了UF3GT与花色形成之间的关系,为利用基因工程方法改良植物花色奠定基础。主要研究方法与结果如下:1.通过cDNA文库筛选和3’RACE的方法克隆得到香雪兰UF3GT基因的全长cDNA序列。序列分析表明,该cDNA序列长为1614bp,其中开放阅读框架长1338bp,编码的蛋白序列长为445个氨基酸,推测蛋白质的分子量是48,043Da,等电点为6.02,命名为Fh3GT1(Genbank登录号:HM590645)。通过Fh3GT1氨基酸的同源性和系统发育树分析表明:该基因是UF3GT基因家族中的一个新成员。2.利用半定量RT-PCR方法分析在红花香雪兰的不同开花阶段、不同器官以及不同花色品种中Fh3GT1基因的表达情况。Fh3GT1基因在红花香雪兰的花、茎、叶中均有表达,当香雪兰花瓣处于完全开放阶段时,Fh3GT1基因的表达量达到最高;在不同花色香雪兰品种中,该基因在红花和粉花香雪兰的花瓣中表达最高,黄花香雪兰次之,而在白花香雪兰中表达量最低。3.构建Fh3GT1基因的重组原核表达载体(pET-Fh3GT1),并在大肠杆菌BL21 (DE3)菌株中诱导蛋白的体外表达并进行酶活检测。SDS-PAGE电泳分析显示重组蛋白分子量约为48 kDa,与预测的该基因编码蛋白的分子量相同。体外酶活检测反应显示反应产物中有花色苷的生成,说明原核表达制备的Fh3GT1蛋白具有糖基转移酶的活性,初步证明我们克隆得到的基因是UDP-葡萄糖:类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶基因。4.构建Fh3GT1::GFP融合表达载体,通过农杆菌侵染法在洋葱(Allium cepa)表皮细胞中瞬时表达Fh3GT1::GFP融合蛋白。对Fh3GT1进行亚细胞定位发现,该蛋白主要分布在细胞质中,属于胞质蛋白。5.构建pBI-Fh3GT1双元表达载体,通过农杆菌侵染法转化矮牵牛,过量表达Fh3GT1基因,验证其生物学功能。结果统计,共得到转基因矮牵牛植株7株,通过PCR和Southern杂交鉴定,表明外源基因基因成功整合到转基因矮牵牛植株的基因组中。得到含有单拷贝Fh3GT1基因的转基因红花矮牵牛5株,其总花色苷含量平均下降40%,花瓣边缘出现白斑和颜色缺失;得到含有二个拷贝Fh3GT1基因的转基因矮牵牛2株,总花色苷含量平均下降80%,花色从红色变成深粉色。6.构建pART-Fh3GT1i干扰表达载体,选择Fh3GT1基因序列中3’端保守区的一段长为347 bp的片段作为靶基因,构建含有内含子的发卡RNA(hpRNA)结构,利用RNAi原理干扰矮牵牛内源UF3GT基因的表达,为研究Fh3GT1基因的功能奠定基础。结果统计,共得到转基因矮牵牛植株5株,通过PCR和Southern杂交鉴定,表明外源基因基因成功整合到转基因矮牵牛植株的基因组中。所得到的转基因矮牵牛植株的总花色苷含量平均下降85%,花色都由红色变成深粉色,并且发现转基因矮牵牛的株型和花型均比野生型矮牵牛矮小。